使用细胞培养单层分离猪流行性腹泻病毒

1971年,在英国的猪群中首次发现猪流行性腹泻(PED),直至1978年,英国和比利时才证实,引起PED的病原体为冠状病毒PED和猪传染性胃肠炎(TGE)是由不同血清型的冠状病毒引起危害以消化器官为主的两个类似的猪的传染病。因此,单靠临床症状和组织病理学检查来作出鉴别诊断是比较困难的,必须借助于血清学和病原学的检验。但是,由于在细胞培养物中使用胎牛血清会起到抑制冠状病毒吸收进入细胞膜受体的作用,使PED病毒在细胞培养物中生长繁殖受阻,从而对PED病毒的应用研究带来了一定的困难。据报道,     

猪流行性腹泻微量血清中和试验的建立和应用

用分离自广东某猪场并适应于传代细胞生长的猪流行性腹泻病毒Ｐ－ＥＤＶＧ＿Ｖ毒株作猪流行性腹泻（ＰＥＤ）微量血清中和试验。检测了五个猪场共１５２份血清，其中未发生过ＰＥＤ的一个猪场３５份血清，抗体滴度≤１：２；三个发生过ＰＥＤ的猪场７７份血清，抗体滴度在１：４～１．５１２；一个接种过ＰＥＤ油佐剂灭活疫苗的猪场４０份血清，抗体滴度在１：８～１：１０２４。猪传染性胃肠炎、伪狂犬病、猪瘟和轮状病毒阳性血清均不能中和ＰＥＤＶ，表明该方法具有准确、可靠、特异性好、操作简便的优点。     

应用~(60)Co照射制备无病原体犊牛血清的试验

犊牛血清是细胞培养中最重要的培养基成分之一，但在犊牛血清中常含有某些微生物，包括支原体和病毒，其中大部分血清中存在牛腹泻病毒（B──VDV），而用常规过滤方法难以清除，影响细胞培养。因此，研究制备无病原体血清的简易方法，满足细胞培养的需要，特别是保存种子传代细胞不被污染具有重要意义。美国Hyclone试验有限公司用照射处理组织培养的动物血清灭活其中存在的病毒，但具体方法未见报道。我们利用(60)~Co源的γ──射线照射的方法制备无病原体犊牛血清,现将初步结果报道如下。（一）(60)~Co源及照射剂量利用华南农业大学广…     

细胞冻存时缓慢降温的简易方法

细胞冻存的妥当与否,会直接影响所冻存的细胞的活力,甚至关系到能否将细胞保留下来的问题。当前一般采用液氮冻存细胞,其基本原则是慢冻速融,特别是从0～-20℃间冷冻速度要缓慢,要控制好。我们国内目前还没有生产诸如CRY-MED型那种程序控制的冷冻器,一般采用经验的方法:冻存细胞的安瓿先放入冰箱,再放低温冰箱,再经液氮罐口氮气熏蒸,逐步下降至液氮内。此法虽然可用,只是操作烦琐,不易掌握好。在此,我们介绍一种简易而有效的缓慢降温的方法,便于细胞冻存。(一)方法与结果     

猪流行性腹泻弱毒疫苗的研究

用从广州地区流行性腹泻病猪分离并适应到Ｖｅｒｏ等传代细胞的猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）Ｇ１强毒株，通过Ｖｅｒｏ、ｐＫ１５、ＳＴ细胞株的连续传代，证明第７２代毒已被致弱。用８３代毒（Ｐ８３）对吃初乳前的小猪以８～１０ｍｌ剂量口服连续传５代，每代都从接种猪小肠取样接种细胞进行培养鉴定，并于增殖后作为次代接种材料，结果５代毒均未引起小猪发病，证实该代次毒株的安全、稳定，达到了常规弱毒疫苗株要求的标准。用Ｐ８３制成弱毒疫苗，对２２头８～１０日龄小猪进行免疾效力试验，１４头口服免疫，８头颈肌注射免疫，剂量均为２ｍｌ／头。免疫后２１ｄ以最小发病量（即原毒液的１：１２稀释液）及原毒液的２倍、４倍和８倍的稀释液经口进行强毒攻击，对照组１２头也以相对剂量同时攻击。结果免疫组仅口服免疫、经大于最小强毒攻击量６倍剂量攻击组中１头（１／２）有一过性轻微腹泻，发病不到２４ｈ即恢复。对照组的１２头中有１０头典型发病，严重腹泻，并有寒颤等症状，病程长达３～６ｄ，７ｄ后腹泻症状消失，但体况明显削瘦。试验证明Ｐ８３制备的弱毒疫苗的总免疫效力达９４．６％，表明Ｐ８３已具备弱毒疫苗株的要求。     

杆状病毒表达的猪传染性胃肠炎病毒钉状糖蛋白在其血清学诊断上的应用

利用从猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）Ｍｉｌｅｒ株（Ｍ５Ｃ）克隆建立的一株重组杆状病毒（Ｒ２－２）表达的重组ＴＧＥＶ钉状糖蛋白（Ｓ），建立了一种阻断酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）来检测猪群抗ＴＧＥＶ抗体。试验表明，用重组病毒Ｒ２－２接种ｓｆ９细胞（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）所表达的重组蛋白量在接种后第７２ｈ达到最高值；该重组蛋白能与抗ＴＧＥＶＳ蛋白Ａ位点的单克隆抗体特异性结合。用阻断ＥＬＩＳＡ检测６８份来自无ＴＧＥＶ感染或ＴＧＥＶ（Ｐｕｒｄｕｅｌ５）免疫的仔猪或母猪血清，结果与ＴＧＥＶ蚀斑减数试验完全相符，灵敏度和特异性均为１００％。同时检测来自ＴＧＥＶ试验免疫猪、美国部分地区猪群、我国进口猪以及我国国内猪群血清６２７份，阳性检出率分别为８２．６１％、６１．６２％、５８．３３％和２９．１０％；用中和试验（微量中和试验或病毒蚀斑减数试验）检测的ＴＧＥ血清抗体阳性率分别为８０．８７％、５９．６０％、５６．１１％和３０．６０％，两种方法对抗ＴＧＥＶ抗体的检出率没有显著差异。     

猪流行性腹泻和传染性胃肠炎弱毒二联疫苗免疫抗体应答的研究

用猪流行性腹泻 (PED)和传染性胃肠炎 (TGE)弱毒二联疫苗 (下称二联苗 )免疫PED和TGE抗体阴性的妊娠母猪 ,仔猪出生后第 7、14、2 1和 2 8d抽取仔猪血样用微量血清中和试验检测血清抗体。结果 ,免疫母猪所产仔猪通过哺乳获得了相当高的血清抗体 ,在出生后第 7d时接近母体的中和抗体水平 ,并随日龄增大而下降。二联苗免疫母猪所生仔猪和相同株的PED、TGE疫苗株免疫母猪所生仔猪的血清抗体变化基本相似。用二联苗免疫PED和TGE抗体阴性的 10日龄仔猪 ,并于免疫后以 7d的间隔 ( 1月龄内 )或半月 ( 1月龄后 )间隔采取血样进行血清抗体检测。结果 ,用二联苗免疫抗体阴性的 10日龄仔猪 ,抗体在免疫后第 2 1d(TGE)或第 2 8d(PED)达到最高值 ,但抗体下降缓慢 ,在免疫后第 5月 ,免疫猪血清中仍能检测出抗体。相同弱毒株的PED和TGE疫苗免疫组的结果与之基本相同。提示 ,PED和TGE弱毒株联合免疫在诱导妊娠母猪和小猪产生抗体以及母猪产后向哺乳仔猪传递抗体方面未见有相互影响的现象。