推进黑龙江深度共融“一带一路”

省委十二届八次全会提出积极拓展与"一带一路"国家和地区交流合作,促进更大范围、更宽领域、更深层次开放,形成高水平对外开放新格局。黑龙江省应实施积极的对外开放战略,建设更高水平开放型经济新体制,全面提高对外开放水平,推动贸易和投资自由化便利化,推进贸易创新发展,推动共建"一带一路"高质量发展,提高在东北亚区域合作中的竞争力。     

猪瘟标记疫苗的研究进展

猪瘟 (Classicalswinefever ,CSF)是世界范围内猪的最严重的疾病之一 ,因而被OIE列为A类传染病 ,其病原为猪瘟病毒 (CSFV)。CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属 (Pestivirus)中的 1个成员 ,属有囊膜的RNA病毒 ,基因组为单股正链RNA ,含有 1个大的开放性阅读框 (openreadingframe ,ORF) ,ORF两侧分别是 5′ 非翻译区 (5′ UTR)和3′ 非翻译区 (3′ UTR)。CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由ORF所编码 ,翻译成 1个含 3898个氨基酸的多聚前体蛋白 ,这一大型前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异的蛋…     

猪水泡病病毒结构蛋白编码区核苷酸的序列测定与分析

以猪水泡病病毒 (Swinevesiculardiseasevirus ,SVDV)HK’70为材料 ,用特异性引物扩增出P1区的 2个重叠目的片段 ,连接于pMD 18 T载体 ,转化JM 10 9感受态细胞。经重组质粒的双酶切 ,PCR鉴定后测序。序列分析表明 ,HK’70P1区核苷酸组成中A含量较高 ,G C含量较低 ,且A G、C T转换率较高。P1序列同源性分析表明 ,SVDVHK’70与J1’73、H/3’76、SVDV(Seechurn等测株 )、NET/1/92的核苷酸序列同源性分别为 97.8%、98.1%、97.6 %和 89.3% ;相应地 ,推导的氨基酸序列同源性分别为 98.8%、98.7%、98.8%和 96 .5 %。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从陕西省榆林市某蛋用种鸡场疑似肾型传染性支气管炎病鸡中分离到了1 株肾型IBV(定名为YL 04),并对分离病毒进行了血凝性、血凝抑制性、致病性、鸡胚矮小化、电镜特征等生物学特性鉴定及S1基因5′端的RT PCR鉴定。结果表明,该分离株经10 g/L胰酶处理后的各代病毒尿囊收集液均可凝集鸡红细胞;标准阳性血清可特异性地抑制其凝集性;可复制出与自然发病相同的病例;病毒传代物有明显的致鸡胚矮小化作用;透射电镜下可见有近似球形、直径100 nm左右的冠状病毒粒子;用RT PCR方法扩增到1 条373 bp的目的片段,其核苷酸序列与IBV CQ/01/2004株序列的同源性达98%。     

鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株M蛋白基因的变异及其B细胞表位稳定性

以陕西8株鸡传染性支气管炎病毒(AIBV)分离株M蛋白的基因序列为基础,应用DNAStar软件中的MegAlign模块对其进行了同源性分析;用Kyte-Doolittle方法、Jameson-Wolf方法、Karplus-Schulz方法、Plot-Emini方法和Garnier-Robson方法综合预测了其中4株代表毒株的M蛋白B细胞抗原表位和二级结构。结果,8株AIBV的M蛋白主要在10~40 aa和90~175 aa处存在无规律的点突变,与参考毒株H52、M41、SAIB20、LX和Gray的M蛋白的核苷酸序列和预测的氨基酸序列的同源性分别介于87.4%~99.5%和96.3%~99.5%;分离株间的核苷酸序列和预测的氨基酸序列同源性分别介于91.8%~99.8%和95.4%~100%。4株代表株的M蛋白B细胞优势抗原表位都在159~164 aa和181~193 aa肽段区(这2个区域都包含了无规则卷曲和β-转角结构)或其附近。结果表明,AIBV分离株的M蛋白基因相对保守,只存在无规律的点突变,该变异对AIBV M蛋白B细胞表位的稳定性无影响。     

猪血管内皮细胞体外生长特性的研究

试验以体外分离培养的猪血管内皮细胞为材料 ,研究了细胞的生长曲线、不同基础培养基对细胞生长的影响及胰岛素在生长液中的适宜含量。结果表明 ,传代猪血管内皮细胞接种后有1d左右的滞留期 ,然后细胞进入对数生长期 ,可持续 2d ,第 5d进入平台期 ,第 8d细胞开始脱落死亡 ;与MEM相比 ,M 199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基 ;在不用贴附基质和内皮细胞生长因子 (ECGF)的条件下 ,生长液中加入胰岛素 ,可明显促进细胞的生长和增殖 ,胰岛素的最适用量为 8μg/mL。     

稳定表达猪瘟病毒NS5A蛋白的细胞系的建立

为了探索猪瘟病毒非结构蛋白5A(NS5A)的功能,成功扩增了猪瘟病毒NS5A基因的DNA片段并构建了猪瘟病毒NS5A基因的重组表达质粒pGFP-NS5A和pNS5A-GFP。然后,将阳性质粒pGFPNS5A、pNS5A-GFP和对照质粒pEGFP-C1在Lipofectamine 2000介导下转染猪血管内皮细胞(SUVEC),活细胞状态下直接观察GFP-NS5A和NS5A-GFP蛋白在SUVEC细胞中的表达与定位。结果显示,猪瘟病毒NS5A蛋白主要定位于细胞质中;进一步的激光共聚焦共定位显示,NS5A蛋白主要定位于SUVEC细胞的内质网上面。在此基础之上,通过含有1 500μg/mL新霉素(G418)的抗性培养基筛选出稳定表达猪瘟病毒NS5A蛋白的细胞克隆。RT-PCR和Western-blot检测结果表明,猪瘟病毒NS5A蛋白可以在SUVEC细胞中稳定转录和表达。上述结果表明,本研究建立了稳定表达猪瘟病毒NS5A蛋白的SUVEC细胞株,为进一步研究NS5A蛋白对SUVEC细胞的生理功能的影响及其在猪瘟病毒致病过程中的作用奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区原核表达载体的构建及表达

用RT PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株 (Shimen)、近期地方流行的属于第 1群毒株的新疆毒株 (XJ)和第 2群代表毒株甘肃临洮 (LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增 ,均得到约 5 6 1bp的基因片段 ;经克隆测序及序列分析 ,该基因编码 187个氨基酸残基 ,预计蛋白分子质量为 2 1.7ku。将这 4个基因分别克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1中 ,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中 ,阅读框是正确的 ,从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL2 1(DE3)中 ,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG )进行诱导表达 ,对表达的蛋白用SDS PAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明 ,E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达 ,表达的蛋白多以包涵体形式存在 ,表达产物的分子质量约为 5 0 .0ku ,与理论推测的分子质量一致 ;薄层凝胶扫描分析表明 ,表达蛋白约占菌体蛋白总量的 2 0 .1% ;免疫印迹结果证明 ,表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。     

胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及免疫预防

从陕西省某猪场分离到 1株细菌 ,经培养特性、形态观察及生化试验等鉴定为胸膜肺炎放线杆菌 (Actinobacilluspleuropneumoniae) ;动物致病性试验对豚鼠、小白鼠有很强的致病性 ;该菌对羧苄青霉素、氯霉素等高度敏感 ,对氟哌酸、复合磺胺等有耐药性。分离菌制成油佐剂灭活苗 ,对猪进行一免后 3 0d抗体凝集效价可达 1∶3 2 ,二免后 3 0d抗体凝集效价可达 1∶12 8以上     

猪瘟流行毒株E2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

用RT PCR方法扩增了陕西省近期猪瘟流行野毒株E2基因 ,并将其克隆到 pMD 18 T载体 ;经转化、筛选、鉴定后 ,测定了核苷酸序列 ,根据C株、Brescia株和Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行 gp5 5氨基酸序列推导 ,并进行同源性比较。结果表明 ,该猪瘟流行毒株的E2核苷酸序列与C株、Brescia株和Alfort株的E2核苷酸序列同源性分别为 81.9%、83.4 %和83.5 % ;相应地 ,gp5 5氨基酸同源性分别为 94 .8%、95 .6 %和 95 .3%。将此E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体 pFastBacHTb后获得了重组质粒 pFBHT E2 ,进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中 ,发生转座作用 ;经抗性及蓝白斑筛选得到了含E2基因的重组DNA ,将其命名为rBacmid E2。此研究为进一步在昆虫细胞中表达E2基因、开发研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础。