小反刍兽疫病毒H基因或F基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

为构建能够表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H基因或F基因的重组山羊痘病毒(GPV)并以此为活载体疫苗,在通用转移质粒pTKfpgigp的多克隆位点中插入PPRV的H基因或F基因,构建重组转移质粒pTKfpgigp-PPRV H和pTKfpgigp-PPRV F,并用Lipofectamine 2000转染已感染GPV的原代绵羊睾丸细胞,经同源重组产生重组GPV(rGPV)。用GFP和gpt选择标记筛选纯化rGPV,通过RT-PCR和免疫荧光技术检测rGPV在原代绵羊睾丸细胞中外源基因的表达情况。将获得的rGPV皮内接种山羊,检测抗山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒的特异性抗体的变化情况。结果显示,获得了含有PPRV H基因或F基因的病毒株rGPV-PPRV H和rGPV-PPRV F;在原代绵羊睾丸细胞中rGPV所含的外源基因进行了正常转录和翻译,表达产物能与PPRV抗血清产生特异性反应,动物免疫试验表明,2株rGPV能诱导产生高水平的抗山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒的特异性抗体。上述研究结果为PPRV重组标记疫苗的研制提供了参考。     

山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFast-BacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测。结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别。     

乙型脑炎病毒E基因自杀性DNA疫苗的构建及其免疫应答

为探讨自杀性DNA疫苗在乙型脑炎疫苗开发中的可能性,将乙型脑炎病毒(JEV)E基因片段插入到自杀性DNA疫苗载体pSCAl(pS)中,构建了表达E基因的自杀性DNA疫苗质粒pSE.间接免疫荧光试验结果证实,该质粒转染BHK-21细胞后实现了E基因在细胞中的表达.将该疫苗和常规DNA疫苗(pCDE)分别免疫试验小鼠,进行体液免疫和细胞免疫检测.结果表明,在诱导体液免疫方面,pCDE要优于pSE,但pSE却可以诱导更强的细胞免疫反应,这为进一步评价该疫苗的免疫保护效果奠定了基础.     

山羊痘病毒糖蛋白基因ORF122的克隆及其原核表达

以山羊痘弱毒疫苗毒株AV41的细胞培养物中提取的总DNA为模板,通过PCR扩增获得山羊痘病毒(GTPV)ORF122基因片段。另设计1对引物,经PCR扩增获得缺失跨膜功能区的ORF122基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达质粒pET-ORF122,将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,成功表达出分子质量为32ku的融合蛋白。免疫印迹试验证实,表达的融合蛋白可以被GTPV阳性血清识别。经对该重组蛋白进行纯化,结果其纯度达到90%以上,产量达5.5mg/L。上述结果为GTPV重组诊断抗原的筛选和新型疫苗的研制奠定了基础。     

绵羊痘病毒E3L基因在Vero细胞中的表达

为了构建组成型表达绵羊痘病毒E3蛋白的真核表达载体,并检测E3蛋白在Vero细胞中瞬时表达的情况,将绵羊痘病毒E3L基因亚克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-E3L,经酶切和测序鉴定正确后转染至Vero细胞,利用Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)对E3蛋白的表达水平进行鉴定。结果显示,转染后第48小时可检测到E3L基因高水平的表达。这一研究结果为进一步研究绵羊痘病毒E3蛋白的生物学功能奠定了基础。     

山羊痘病毒L1R蛋白的原核表达及其免疫原性的研究

为探究山羊痘病毒L1R蛋白的免疫原性,将山羊痘病毒的L1R基因克隆到p ET-30a(+)原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后进行纯化,将纯化的重组L1R蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、淋巴细胞增殖和微量中和试验研究重组L1R蛋白的免疫原性及其多克隆抗体的抗病毒作用。结果显示,成功表达出分子质量约为26 ku的目的蛋白,其可被山羊抗绵羊痘阳性血清所特异性识别。重组L1R蛋白能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫,并且其多克隆抗体能够中和山羊痘病毒,从而证实山羊痘病毒L1R蛋白具有良好的免疫原性。     

山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达.通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30...     

表达Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株的构建

为构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒(GTPV)弱毒株,将Asia 1型FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因、蛋白酶3C基因、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、痘苗病毒启动子(p7.5)相连,构建成一整体基因表达盒p7.5-EGFP-P12A3C.以GTPV胸苷激酶基因序列中的Kpn Ⅰ酶切位点为插入位点.将整体基因表达盒插入转移载体骨架pUC119-TK中,构建GTPV转移载体pTK-p7.5-EGFP-P12A3C.将转移载体转染GTPV弱毒株AV 41感染的BHK-21细胞,转染后24 h就可见到绿色荧光,表明,成功获得了能表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV.     

山羊痘病毒L1蛋白的原核表达及其功能分析

为了探究山羊痘病毒L1蛋白在病毒感染Vero细胞过程中的作用,将山羊痘病毒L1蛋白基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物。表达的目的蛋白经镍亲和柱纯化后免疫家兔制备了抗血清,通过蛋白封闭试验和血清抑制试验研究了纯化蛋白及其抗血清对山羊痘病毒感染的抑制作用。结果显示,成功表达了山羊痘病毒的L1蛋白,表达产物为48ku左右的重组蛋白,它能被山羊抗山羊痘病毒阳性血清识别。加入L1蛋白封闭,可使山羊痘病毒感染细胞的病变时间推迟12h,病毒与L1蛋白抗血清作用后效价下降了87.8%。结果表明,L1蛋白可能是山羊痘病毒的受体结合蛋白,并能在病毒侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。     

山羊痘病毒感染绵羊的诊断及其p32基因的分子分析

采用细胞培养方法从发生羊痘的绵羊肺组织中分离到1株山羊痘病毒GPV/GSgulang/09,对分离株的p32基因进行了PCR-RFLP和序列比对分析.结果显示,GPV/GSgulang/09株p32基因的扩增产物被Hinf I酶切后出现山羊痘病毒(GPV)特征性的2条带;p32基因序列第166～168位缺失绵羊痘病毒(...     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

小反刍兽疫病毒样颗粒装配的研究

为了探究小反刍兽疫病毒(PPRV)是否能够装配成病毒样颗粒(VLPs),选取PPRV的4个结构蛋白(基质蛋白M、核蛋白N、血凝素蛋白H和融合蛋白F)基因,分别构建其真核表达载体,利用间接免疫荧光试验和Western-blot检测表达情况,并在Vero细胞上进行共表达,电镜下观察VLPs的装配情况。结果显示,构建的4个真核表达载体在Vero细胞上均得到了高效表达;共表达的4种蛋白在Vero细胞上成功装配并释放了PPRV VLPs,其形态和大小与PPRV Nigeria 75/1株感染细胞后观察到的病毒粒子的形态和大小一致。经免疫电镜检测,装配形成的VLPs能够识别特异性抗体。结果表明,本试验成功装配并释放了PPRV VLPs,为后续研制高效、安全的PPR新型疫苗奠定了基础。     

CD44受体分子对口蹄疫病毒感染的影响

为探索CD44分子在口蹄疫病毒(FMDV)感染中的作用,揭示FMDV的感染机制,为开发阻断FMDV入侵的药物和高效疫苗提供新靶点。采用Western-blot、TCID50检测、激光共聚焦显微镜检测等方法,检测FMDV感染BHK21细胞后CD44的表达水平,以及用抑制剂MβCD抑制CD44表达后对FMDV增殖的影响。Western-blot结果显示,FMDV感染BHK21细胞后,CD44的表达量显著上升(P0.05);用MβCD抑制内源性CD44表达后,FMDV的增殖水平显著降低(P0.05)。TCID50检测结果显示,用MβCD抑制CD44表达后,FMDV的表达显著降低(P0.05)。激光共聚焦结果显示,FMDV感染BHK21细胞后CD44的表达量上升。表明,CD44分子参与FMDV的感染过程,可能作为调控分子直接或间接参与FMDV的入侵过程,仍需要进一步研究。     

口疮病毒VEGF基因的原核表达及亚细胞定位

为了对口疮病毒(ORFV)VEGF基因进行原核表达和亚细胞定位研究,PCR扩增VEGF基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)和真核表达载体p EGFP-C3中。将原核表达重组质粒转化至E.coli Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。将真核表达重组质粒转染BHK21细胞,利用激光共聚焦观察VEGF蛋白在BHK21细胞中的亚细胞定位。结果表明:VEGF蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为33 ku。Western-blot结果表明,VEGF蛋白具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1∶8。VEGF蛋白在转染BHK21细胞后主要在细胞质中表达,且能够与制备的多抗血清反应。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了一定的基础。     

山羊痘病毒P32抗原基因口服活载体DNA疫苗的构建

以减毒鼠伤寒沙门菌X 4550为载体,构建编码缺失跨膜区和疏水区的山羊痘病毒P32基因的新型口服活载体D N A疫苗,通过体外传代培养、大剂量接种试验、免疫组织化学试验、ELISA等对其安全性、稳定性、免疫原性及免疫效果等进行综合检测评价。结果表明,X4550/pVAX1-P32在体外可稳定传代100代以上,小鼠口服1×10~(10)CF U X4550/pVAX1-P32后存活率为100%,接种后第10天仍能从脾中分离到X4550/pVAX1-P32,表明X4550/pVAX1-P32在体内外均具有良好的安全性和稳定性。免疫组织化学试验结果显示免疫小鼠脾细胞内有黄褐色粗颗粒,表明X4550能将pVAX1-P32有效递呈至免疫效应细胞并在其内表达具有生物活性的P32蛋白。ELISA结果显示,X4550/pVAX1-P32免疫组的抗体水平显著高于pVAX1-P32免疫组(0.01P0.05),且X4550/pVAX1-P32免疫组能诱导持续时间更长的抗体水平(P0.01),表明活载体疫苗X4550/pVAX1-P32具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生持久的、高水平的免疫应答,这为羊痘新型疫苗的研究和应用奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因与报告基因lacZ双表达质粒的构建及体外表达

利用反转录和套式PCR技术,从猪瘟病毒(CSFV)石门血毒中扩增出了E2 基因,将其用NotⅠ和XhoⅠ双酶切后,与同样处理的真核表达载体pBudCE4.1 相连,获得了pBudCE Es2 22的阳性质粒。对后者再以HindⅢ和XbaⅠ双酶切,并与来自质粒pBudCE lacZ/CAT的lacZ基因片段连接,获得了含CSFV E2基因与lacZ报告基因的真核双表达质粒pBudCE lacZ/Es2 22。该质粒转染BHK21细胞后,用βGal Staining试剂盒原位染色可见许多着染蓝色的细胞;用CSFVAntigen试剂盒检测转染细胞的上清液和细胞沉淀,均可检测到含CSFV E2 抗原。结果表明,构建的真核质粒pBudCE lacZ/Es2 22实现了2个外源基因的共表达。     

绵羊BST-2B基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了表达含有绵羊BST-2B(o BST-2B)基因的重组蛋白,用RT-PCR方法扩增绵羊肺细胞的o BST-2B基因,并将其克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组表达质粒p GEX-4T-o BST-2B。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组o BST-2B蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备抗o BST-2B的多克隆抗体。蛋白免疫印迹分析和间接免疫荧光试验检测结果显示,该抗体具有较好的反应原性。本试验成功制备的o BST-2B蛋白及多克隆抗体,为研究o BST-2B蛋白的生物学功能及羊传染病的致病机制提供了良好的基础材料。     

IFN-λ1作为乙型脑炎病毒DNA疫苗佐剂的免疫效应研究

为了评估IFN-λ1作为免疫佐剂能否提高乙型脑炎病毒DNA疫苗的免疫效应,利用RT-PCR方法扩增猪源IFN-λ1基因,构建重组真核表达载体pVAX1-IFN-λ1,通过Western-blot和间接免疫荧光试验鉴定免疫效果。结果表明,转染pVAX1-IFN-λ1重组质粒的BHK21细胞能够正确表达IFN-λ1;将重组IFN-λ1与p VAX1-prME DNA疫苗免疫小鼠后,与对照组p VAX1-prME相比,IFN-λ1可以诱导小鼠产生乙型脑炎病毒EⅢ蛋白特异性抗体水平、乙脑病毒特异性中和抗体效价和淋巴细胞增殖水平显著提高。结论,重组猪源IFN-λ1作为乙型脑炎病毒DNA疫苗的分子免疫佐剂能够在小鼠动物模型上提高乙型脑炎病毒DNA疫苗的免疫效应。     

密码子优化对鸭坦布苏病毒E基因DNA疫苗免疫应答的增强作用

为提高DNA疫苗用于预防鸭坦布苏病毒病的免疫原性,将鸭坦布苏病毒的E基因密码子改造为鸭偏嗜的密码子,并将其作为免疫原基因克隆到pCAGGS载体中,构建真核表达质粒pCAGGS-OptiE。将pCAGGS-OptiE和先前构建的编码野生型E基因的表达质粒pCAGGS-E分别转染293T细胞,用间接免疫荧光和Western-blot检测E蛋白的表达情况。结果显示,密码子优化的重组质粒的蛋白表达量明显高于野生型质粒。将重组质粒pCAGGS-OptiE和pCAGGS-E用脂质体包裹后分别尾静脉注射免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测抗体的产生情况。结果显示,质粒pCAGGS-OptiE诱导的抗体水平明显高于pCAGGS-E,表明密码子优化的E基因能够提高蛋白的表达水平,进而增强机体免疫应答反应。     

猪肺炎霉形体p52基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经Pine Ⅰ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-293细胞,包装成完整的腺病毒,经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定后扩增,收集病毒液,免疫BALB/c小鼠,并分析了体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫效果.结果表明,重组质粒pShuttle-CMV-P52插入片段为1 202 bp;同源重组成功;重组腺病毒可以正确表达目的蛋白,效价达1×106TCID50/mL.重组病毒经肌肉注射和滴鼻均可诱导小鼠产生血清和肺匀浆液特异性IgG、SIgA,但不能诱导特异的淋巴细胞增殖.证实,成功构建了表达p52基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和黏膜免疫,但不产生细胞免疫应答.