美洲型与欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型经典毒株、高致病性变异毒株以及欧洲型毒株基因组的序列差异,设计2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及欧洲型毒株的多重荧光定量RT-PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.999以上;特异性强,只有PRRSV出现阳性反应,而与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性高,经典毒株、变异毒株、欧洲型毒株的检出下限分别为1.13、1.37、1.39copies/μL,均比普通RT-PCR敏感100倍;重复性好,组内及组间变异系数均小于1.5%。应用所建立的方法对采集的282份临床病料进行检测,结果 PRRSV阳性101份,其中95份为变异毒株、6份为经典毒株、4份为变异毒株和经典毒株混合感染,未检测到欧洲型毒株。结果表明,本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可为PRRSV的快速鉴别诊断及流行病学调查提供有效的技术手段。     

猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别检测方法,针对PEDV基因序列设计3对特异性引物。第1对引物扩增野毒株(经典株、变异株)和疫苗株ORF3基因198 bp和148 bp片段;第2对引物扩增经典株和疫苗株S基因429 bp片段;第3对引物扩增变异株S基因274 bp片段。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PEDV经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异地检测PEDV,而与猪的其他重要病原FMDV、CSFV、PRRSV、TGEV、PRo V、PCV2、PRV无交叉反应;对重组质粒标准品的检出下限为2.62×10~2copies/L;重复试验获得了均匀一致的结果。应用该方法检测336份临床病料,PEDV阳性的120份,其中变异株96份、疫苗株21份、变异株和疫苗株混合感染3份。结果表明,本研究所建立的多重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于PEDV经典株、变异株和疫苗株的快速鉴别检测和流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用微芯片荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立一种可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用的核酸检测技术,本研究根据已发表的多株PRRSV ORF6(M)基因保守序列,设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种可用于PRRSV通检的微芯片荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,与多种常见的猪病病毒均无交叉反应;通检性好,可以检出包括美洲型、欧洲型、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及NADC30-like等多种基因型PRRSV毒株;灵敏性好,检测下限为1×10~1TCID_(50)/mL,与常规荧光RT-PCR方法一致;重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于4%;且成本低,模板用量少,反应快速,全程仅需61 min;对80份临床样品的检测结果与常规荧光RT-PCR的符合率为100%。本研究建立的微芯片荧光定量RT-PCR技术为PRRSV的快速、通用型检测提供了有力的技术支撑。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株与经典毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的快速RT-PCR检测方法,根据GenBank中PEDV S基因序列设计合成1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV变异毒株的RT-PCR方法。结果显示,建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分疫苗株CV777和PEDV变异毒株,仅能扩增出PEDV变异毒株826bp的目的片段,与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法能检测到的最低核酸质量为11.3pg。利用该方法对采集自广西部分地区的123份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV阳性率为67.5%,变异毒株占总PEDV毒株的86.7%(72/83)。结果表明,该RT-PCR鉴别诊断方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。     

PRRSV高致病性毒株和经典毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR鉴别方法的建立

根据猪生殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株、经典毒株Nsp2基因序列的差异,应用Oligo软件设计了2对特异引物,建立了鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法.用该方法检测JEV、CSFV、FMDV和PRCV均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验显示,其变异系数均低于0.3%,具有良好的重复性.应用该方法对人工感染动物进行检测,自感染后第3、5、7、10、14、21 d分别采集全血,检测结果均为阳性.证实,本试验所建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以快速、准确地鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株.     

高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立

根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株.以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价.结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×109～3.15×100copies/uL具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.998;最低检测限为3.15 copies/uL.对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%.表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪嵴病毒3D基因保守序列设计引物和Taq Man探计,通过优化反应体系,建立了猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性评价;同时以10倍梯度稀释的质粒标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,构建定量分析模型。结果显示,建立的方法能特异性检测猪嵴病毒,与其他引起猪腹泻的病毒无交叉反应,对标准品的检测灵敏度达10 copies/L;标准曲线Ct值和模板终浓度在107~10 copies/L范围内有良好的线性关系;重复性试验变异系数均小于2.5%。对139份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR阳性检出率为30.94%(43/139),常规RT-PCR为29.50%(41/139)。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪嵴病毒的快速检测和流行病学调查。     

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒间接免疫荧光鉴别方法的建立

应用2株针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的单克隆抗体(McAb-A61,McAbC65)建立了对PRRSV美洲株、欧洲株和高致病性毒株进行鉴别的间接免疫荧光试验(IFA)方法,并与商品化的PRRSV RT-PCR鉴别试剂盒进行比较.结果显示,McAb-C65与PRRSV美洲株和高致病性PRRSV毒株均呈阳性反应;McAb-A61与PRRSV美洲株呈阳性反应,但不与高致病性PRRSV毒株发生反应;2株单抗都不与欧洲株反应;IFA与RT-PCR的符合率为100%.表明,建立的PRRS间接免疫荧光鉴别诊断方法可为临床高致痛性PRRS的确诊提供可靠的验证手段.     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒及鉴别类NADC30毒株的双重荧光定量PCR方法

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）保守区和类NADC30毒株的双重TaqMan探针荧光定量PCR方法,分别针对保守的N蛋白基因和Nsp2基因设计特异性引物和探针,通过优化反应体系及反应条件对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估。结果显示,双重标准曲线的相关系数（R2）均大于0.990,具有良好的线性关系;最低检测限分别为5.27 copies/μL和3.00 copies/μL,具有较高的灵敏度;不与其他常见猪病病原发生非特异反应,且重复性良好,批内批间变异系数均小于3%。对168份临床样本的检测结果显示,PRRSV总阳性检出率为68.45%(115/168),其中类NADC30检出率为32.14%,混合感染率为20.24%,与临床诊断结果相一致。结果表明,本方法可用于检测PRRSV和鉴别类NADC30毒株以及猪繁殖与呼吸系统综合征的流行病学调查。     

猪环曲病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪环曲病毒N基因保守序列设计特异性引物与TaqMan探针,建立猪环曲病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法能检测猪环曲病毒,而对猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪星状病毒、A群猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪嵴病毒和伪犬病病毒等核酸的检测均无交叉反应,具有良好的特异性;建立的定量标准曲线Ct值和模板终浓度在109~102copies/L范围内有良好的线性关系,该方法检测灵敏度可达102copies/L;重复性试验的组内、组间的变异系数均小于2.5%。对88份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR检出30份猪环曲病毒阳性,常规RT-PCR检出28份猪环曲病毒阳性,两种方法的符合率为93.34%。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪环曲病毒的快速检测和流行病学调查。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白糖基化位点缺失突变株的构建

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增GP5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码GP5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pVR-N51A。在体外转录后转染BHK-21细胞,转染后第48小时收集细胞接种Marc-145细胞,进行突变病毒的拯救。然后通过RT-PCR扩增拯救病毒GP5蛋白的编码序列,序列分析显示构建正确。间接免疫荧光试验证明拯救病毒能够正常表达GP5蛋白。同时,中和试验结果初步表明GP5糖基化位点缺失影响PRRSV与中和抗体的反应。猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白不同糖基化位点缺失突变株的获得将为进一步揭示GP5蛋白糖基化与诱发机体免疫反应之间的关系奠定基础。     

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲型标准毒株（ＡＴＣＣＶＲ－２３３２）的ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７的序列,设计合成了一对引物２６３７４ＰＳ／２６３７５ＰＲ,用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术对６株ＰＲＲＳＶ北京分离株进行了检测。结果该引物对６株病毒均能扩增出与预期大小相符的ＲＴＰＣＲ产物,并与ＡＴＣＣＶＲ２３３２株扩增产物的大小相当,而欧洲型标准毒株（ＬＶ株）未获扩增片段。进一步用限制性内切酶进行酶切分析,发现这６株病毒及ＡＴＣＣＶＲ－２３３２的ＰＣＲ产物皆出现相同的限制性酶切图谱,证实６株病毒均为ＰＲＲＳＶ。     

三种猪繁殖障碍性病毒混合感染的分子生物学调查

根据GenBank登录的PRRSVORF7、PCV 2ORF1基因及PRVTK基因的核苷酸序列设计合成引物 ,建立了分别用于检测PRRSV、PRV及PCV 2的RT PCR及PCR方法。应用该方法对 77份可疑病料进行了检测 ,以调查猪群中PCV 2与PRRSV和 (或 )PRV混合感染情况。结果表明 ,2 4份样品表现为PRRSV与PCV 2混合感染 ,占样品总数的 31.2 % ;17份样品检测为PRRSV与PRV混合感染 ;9份样品表现为PCV 2与PRV混合感染 ,占 11.7% ;另外 ,还有一定比例的三重感染 ,共 8个样品 ,占 10 .4 %。结果显示 ,猪群中PRRSV、PRV与PCV 2的混合感染现象比较普遍     

猫源弓形虫虫株的分离与鉴定

将猫的心、脑、舌用盐酸-胃蛋白酶溶液消化处理后接种小白鼠,经连续传代分离弓形虫虫株,用特异PCR方法对所分离的虫株进行了鉴定。分别从24只猫的样品中分离出8株弓形虫虫株,用弓形虫种特异的PCR方法对8个虫株进行鉴定,均得到弓形虫的特异条带;测序证明所扩增出的DNA片段确为弓形虫的核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS-1)部分序列。研究结果表明,将动物组织用盐酸-胃蛋白酶溶液消化处理后接种小白鼠是一种分离弓形虫虫株较为理想的方法,特异PCR方法能准确、快速地鉴定弓形虫虫株。     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

广西区2008-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的遗传变异分析

为了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,对2008-2011年间来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2基因的扩增和测序分析。结果显示,获得的49个毒株均为美洲型,其中46株具有高致病性变异毒株的序列特征,即其Nsp2蛋白缺失第481位和第533～561位aa,其余3株不具有上述缺失,属于PRRSV传统毒株。广西区49个毒株Nsp2基因间核苷酸序列的同源性介于84.8%～99.7%,与VR-2332、CH-1a、HB-1及JXA1株核苷酸序列的同源性分别为80.5%～83.7%、89.7%～92.6%、92.4%～96.3%、92.8%～99.3%,而与LV株核苷酸序列同源性仅为51.0%～53.9%。基于Nsp2基因核苷酸序列所绘制的遗传进化树,可将所有美洲型PRRSV毒株分为4个亚群,广西区的49个毒株有3株分布在以HB-1株为代表的Ⅲ亚群,46株分布在以JXA1株为代表的Ⅳ亚群。表明,当前广西区PRRSV流行毒株均为美洲型毒株,并且以Ⅳ亚群为优势基因亚群,各毒株间的Nsp2基因序列存在一定的差异,但没有明显的地域特征。     

检测987p+肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立

以 98 7p菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了 1对可扩增 45 9bp目的片段的引物 ,建立了检测肠毒素性大肠埃希氏菌 987p菌毛基因的PCR方法。该方法对K 88 ( 为菌毛阳性 )、K 99 、F 41 参考菌株和链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该方法的敏感度可达 10 2 CFU ,对 2 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,有 1株为阳性 ,与血清学检测的结果一致。结果表明 ,此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床 987p肠毒素性大肠埃希氏菌病的快速诊断和流行病学调查     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀,对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明,用所获得的3 株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外,用IIF检测7 头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片,其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应;对这2头猪的肺组织进行病毒分离,在盲传到第4代时Marc 145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠,且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pEGFP-NSP9的构建与表达

为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染Marc145细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和NSP9基因转录水平。结果显示,经双酶切及PCR鉴定,目的基因的大小与预期相符。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有NSP9基因的转录。本研究成功构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因GFP融合表达质粒,为在细胞水平快速筛选有效的siRNAs提供了工具。