牛实验性小肠钳闭后血液酸碱紊乱的研究

牛的小肠钳闭发病急剧,变化迅速,死亡率极高。尽管我们尚未查到有关牛小肠钳闭后发生的酸碱紊乱的材料,但根据内藤善久、孙长美等对小肠套叠、小肠扭转等的临床和实验研究的结果,这类有肠系膜血行障碍的机械性肠梗阻在发病后引起的酸碱紊乱往往是     

黄牛实验性小肠扭转的血浆游离氨基酸变化的研究

血浆中的游离氨基酸是氨基酸在各组织间转运的主要形式,在正常情况下,它的浓度虽然不高、变化不大,但更新迅速。在病理状态下,随着各组织内氨基酸代谢的改变。血浆游离氨基酸在各组织间的转运也发生相应改变。牛小肠扭转后各重要器官和组织都有不同程度的功能紊乱和细胞损害,在糖、蛋白质和脂质代谢上也有不同程度的改变,特别在病演进入中期以后这些剧烈变化在血浆游离氨基酸的转运上也会反映出来。因而研究其在小肠扭转全病程中的动态变化,探讨其机理是有必要的。     

实验感染急性兔瘟病例酸碱平衡及肾功能病理改变的观察

为掌握急性“兔瘟”在发病过程中的体内变化规律,为综合防治提供依据,我们对46例实验感染急性“兔瘟”病例体内酸碱平衡及肾功能病理改变等方面的研究情况简要报告于后。 (一)材料和方法 本试验所用动物、感染用病料、感染方法及感染前后的临床观察,均与《实验感染急性兔瘟病例肝功能病理改变的观察》一文相同(见本刊1987年第6期)。感染前的血样简称第一组,作为健康对照值;感染后体温升达最高值并开始下降时所采血样简称第二组;濒死期所采血样简称第三组。本实验所进行的生化检验项目及方法如下:     

黄牛实验性十二指肠阻塞后糖代谢紊乱的研究

反刍动物糖代谢有其独特的规律,牛肠扭转后出现血糖升高在国外文献中虽有提及,但研究牛十二指肠阻塞后糖代谢紊乱的发展规律,并探讨其原因,在临床上仍有重要意义。 (一)材料与方法 1.实验动物:黄牛6头,来自淮阴地区。十二指肠阻塞动物模型的制作方法和测定时间见急腹症研究Ⅱ(江苏农学院学报, 3(1),1982)。     

牛脊柱畸形综合征HRM-非标记探针检测方法的建立与应用

为建立用于牛脊柱畸形综合征(CVM)检测的高分辨率熔解曲线(HRM)非标记探针法,根据Gen Bank中SLC35A3基因序列设计PCR引物及非标记性探针,构建G/G型、G/T型、T/T型3种标准质粒,利用质粒作为标准品建立HRM特征图谱。采用优化的HRM-非标记探针法对305份荷斯坦奶牛血样及冷冻精液样品中SLC35A3位点的基因型进行检测,同时采用测序法进行验证。结果,305份样本中9份冻精样本为CVM携带者,携带率为2.95%,检测结果与测序法检测结果一致,准确率达100%。上述研究结果表明,本研究建立的针对牛CVM中SLC35A3基因G-T位点突变检测的HRM-非标记探针方法是一种简单快速、灵敏特异、高效准确的牛CVM有害基因分型检测技术。     

用琼脂扩散试验检测滤纸片血样中小鹅瘟抗体

用琼脂扩散试验检测滤纸片血样中小鹅瘟抗体田晋红（四川畜牧兽医学院荣昌６３２４６０）近年来，国内外运用滤纸吸取血样进行某些疫病的抗体检查，这种方法不需要分离血清，且采血方便、操作简单、易于运送和保存。本试验利用琼脂扩散试验（ＡＧＰ）检测滤纸片血样中的小...     

黄牛实验性肠梗阻血清酶变化的研究

目前,血清酶的测定已广泛用于兽医临床疾病的诊断,特别是肝脏、胰腺、心肌、骨、肌肉等疾病的诊断。我们在黄牛实验性肠梗阻对血清中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷-草和谷-丙转氨酶(SGOT和SGPT)、碱性磷酸酶(AKP)、淀粉酶及过氧化氢酶等作了动态观察,对牛肠梗阻的诊断和判断预后提供了有参考价值的材料。 (一)材科和方法 1.实验动物:与黄牛实验性十二指肠阻塞的糖代谢紊乱的研究及黄牛实验性小肠钳闭和扭转糖代射紊乱的研究同时进行。 2.测试项目与方法:G-6-PD:高铁血红蛋白还原试验法;LDH:比色测定法;AKP:改良金氏法;SGOT和SGPT:改良穆氏法;淀粉酶:苏木杰氏法;过氧化氢酶:高     

牛白血病病毒前病毒DNA荧光PCR检测方法的建立及应用

为快速检测牛外周血淋巴细胞中的牛白血病病毒(bovine leukem ia vir,uBsLV)前病毒DNA,选取BLVenv基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立检测牛白血病前病毒DNA的荧光PCR方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性评价及实际样本的验证检测。结果显示,该方法具有很高的特异性和重复性,最低检出限为每个反应可检出3个拷贝数的阳性标准质粒对照。在175头BLV抗体阳性牛中,用该方法共检出127头BLV感染牛。在262头BLV抗体阴性牛中,用该方法检出2头BLV感染牛,该方法与套式PCR之间检测结果的符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的方法可用于BLV感染牛的确证。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌二重实时荧光PCR检测方法的建立

根据结核分枝杆菌23SrRNA基因序列和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计了2对针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法特异性好,能区分不同模板浓度组合的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;可检测到10copies模板的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;对保存的50份PPD检测阳性牛的鼻黏液、牛乳和淋巴结进行检测,结果6份结核分枝杆菌阳性,1份牛分枝杆菌阳性,其余均为阴性,与PCR的检测结果一致。由此可见,建立的二重实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、可定量检测等优点,适合用于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的鉴别检测。     

牛地方流行性白血病液相蛋白芯片检测方法的建立

应用xMAP液相芯片技术原理,以原核表达的重组牛白血病病毒gp51蛋白为抗原,建立了检测牛白血病病毒抗体的LiquiChip液相蛋白芯片检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性与稳定性试验。结果表明,该方法对牛白血病病毒阳性血清检测阳性,对其他常见牛病毒阳性血清检测阴性,表明特异性好;液相蛋白芯片方法对牛白血病病毒抗体的检测敏感性可达119.7ng/μL,对多份牛白血病病毒阳性血清的检测结果显示该方法的检测敏感性与商品化ELISA试剂盒无显著差异;对3份牛白血病病毒阳性血清进行4次重复检测,批内、批间的变异系数均低于10%。所制备的偶联微球芯片保存3个月,其检测结果无显著差异。采用该方法对169份临床牛血清样品进行检测,检出阳性率达57.4%,该检测结果与瑞典进口ELISA试剂盒检测结果的符合率为94.67%。本方法为牛地方流行性白血病的进出境检疫、疫病监测和流行学调查研究提供了一种特异、敏感的新型快速检测技术。     

牛细小病毒DPO-PCR检测方法的建立

为建立牛细小病毒的快速检测方法,以牛细小病毒VP2基因为靶基因,设计了1对双启动寡核苷酸(dual-priming oligonucleotide,DPO)引物,建立了牛细小病毒DPO-PCR快速检测方法。退火温度不敏感试验、特异性试验和灵敏度试验的结果显示,与常规PCR方法相比,DPO-PCR方法在41～65℃退火温度范围内均能够高效地扩增出目的基因,表明DPO引物对退火温度不敏感;该方法的最低检出量为3.94×10~3copies/uL;通过对牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒进行检测,只有牛细小病毒的检测结果为阳性,且无非特异性扩增。结果表明,建立的DPO-PCR方法同传统PCR方法相比,特异性强、灵敏度高,为牛细小病毒的快速检测提供了一种新方法。     

牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,扩增基因片段长约171 bp,符合目的基因大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的最低检测量为53.3 copies/uL。用该方法检测牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和猪细小病毒,结果显示,只有牛细小病毒可以被检测到,而其他病毒均未被检出,表明该方法具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。结果表明,本研究建立的基于NS1基因的牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性,可用于牛细小病毒感染的检测。     

牛冠状病毒牛肠病毒牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法的建立与应用

为建立一种可以快速检测牛冠状病毒（BCoV）、牛肠病毒（BEV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光PCR方法并应用于临床检测,根据BCoV N基因、BEV 5′-UTR基因、BVDV 5′-UTR基因设计3对特异性引物和探针,通过对引物、探针的浓度以及反应条件的优化,建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法,并对该三重PCR方法的敏感性、重复性、特异性和临床样本检测结果进行了评价。结果显示,该方法灵敏度高,对BCoV、BEV和BVDV的最低检测限为10 copies/μL;重复性稳定,批内和批间变异系数（CV）均在2%以下;特异性强,对常见腹泻类病原无交叉反应。应用此方法检测河南省445份牛腹泻粪便样本,BCoV、BEV和BVDV的阳性率分别为6.5%(29/445)、17.5%(78/445)、12.1%(54/445)。上述结果表明,本研究建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒一步法三重实时荧光PCR方法,为疫病的快速检测及预防提供了有效的技术手段。     

结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法的建立

根据结核分枝杆菌与牛分枝杆菌基因组的比对分析结果,针对结核分枝杆菌与牛分枝杆菌153bp、RD10和TbD1的3处差异缺失区域设计引物,分别建立了结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法.应用建立的3种方法分别对84株结核分枝杆菌、3株牛分枝杆菌、51株非结核分枝杆菌及9种其他常见菌株进行了检测.结果显示,用针对153 bp缺失片段建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出645 bp及492 bp的目的条带;用针对RD10、TbD1建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出478 bp及361 bp的目的条带、358 bp及524 bp的目的条带.这3种PCR检测方法的准确率和特异性均为100%.敏感性试验结果显示,这些检测方法对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌基因组DNA的检测极限均为10 pg.表明,此方法可用于牛源或人源结核分枝杆菌及牛分枝杆菌的快速鉴别检测.     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

奥地利猪水泡病发生情况的血清学初步调查结果

从1972年12月到1974年4月,在奥地利共记录了25次SVD的爆发,为了获得本病在奥地利的发病率概况,曾着手实行了大规模的检查计划。这些至今有用的结果的根据是2182份来自非可疑猪群的血样以及来自天然感染SVD畜群的136份以上的猪血样和85份牛血样。此外,还对8头实验性感染猪的血清进行了一定时期的检验。 来自天然感染猪群的血样,从感染开始至8周后恒呈高抗体滴度。在试验性感染的动物中,5个月后抗体滴度为64。在2182份检验过的猪血样中,94％对血清中和试验呈完全的阴性反应,仅有9份样品的抗体水平在阳性范围内。从这些结果来看,似乎本病未在奥地利广泛蔓延。     

牛支原体肺炎PCR诊断方法的建立及初步应用

参照GenBank中牛支原体脂蛋白P48基因序列,设计并合成特异性引物Mb-F/Mb-R,建立了牛支原体PCR检测方法,并在扩增条件优化的基础上,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,进而应用建立的方法完成了疑似牛支原体肺炎临床病料的检测。结果显示,建立的PCR方法对牛支原体的核酸样品能扩增出534 bp的特异性目的片段,而对无乳支原体、丝状支原体、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、肺炎克雷伯氏菌、黏质沙雷氏菌、变形杆菌等牛常见条件病原微生物核酸样品均未见明显的扩增条带,且其可检测出的牛支原体DNA最低浓度约为0.000 002 875μg/mL。对临床样品的检测结果显示,该方法的检出率与与病原分离的符合率为100%。上述结果表明,本研究成功建立了牛支原体PCR检测方法,可用于临床上牛支原体肺炎的快速诊断。     

牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法的建立

为建立一种适用于基层兽医实验室特异、敏感、快速检测牛巴贝斯虫感染的方法,以牛巴贝斯虫球状体蛋白4(SBP4)基因为靶基因设计引物,建立检测牛巴贝斯虫的巢式PCR方法。结果表明,该方法可特异性地检测牛巴贝斯虫感染,与14种动物梨形虫无交叉反应。该方法能够检测到1 copy的SBP4基因,其敏感性分别是对应的内、外引物普通PCR的10倍和1 000倍。应用该巢式PCR方法,对田间随机采集的136份野外样品进行检测,检出阳性样品9份,显著高于AbouLaila等报道的方法(5份)。这些数据表明,建立的巢式PCR方法可用于基层兽医实验室敏感、准确地检测牛巴贝斯虫感染。     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

牛蓝舌病病毒VP7抗体胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。