用于诊断4种猪病毒病的寡核苷酸芯片的研制

制备可同时检测引起集约化养猪业常见4种传染病,病毒(猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳)的寡核苷酸芯片。根据4种猪疫病病毒特异性基因的保守区域设计合成了60 mer寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片。采用不对称PCR和间接荧光标记技术进行单链DNA扩增和荧光标记,标记样品与寡核苷酸芯片杂交后,进行芯片清洗、扫描及结果分析。杂交结果显示,4种病毒的寡核苷酸检测探针均特异地与相应的标记样品杂交,芯片上呈现较强的阳性杂交信号,而除阳性质控探针外,阴性对照和空白对照均检测不到荧光信号。证明寡核苷酸芯片适用于快速、准确、高通量地诊断影响集约化养猪业的多种猪疫病病毒。     

用于检测仔猪致病菌的23S rRNA基因芯片的研制

以副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、猪链球菌等12种仔猪致病菌为目标细菌,23SrRNA基因为靶基因,从GenBank中下载其23SrDNA全序列,在其变异区设计特异性探针,在保守区设计通用引物。通过序列分析、PCR靶标与探针杂交试验,建立了有13条寡核苷酸探针和2对通用引物的仔猪常见致病菌基因芯片检测方法。以参考菌株粗提基因组DNA的10倍系列稀释模板做PCR,扩增产物与探针杂交,检出芯片的灵敏度为100fg。对33个参考菌株用芯片检测,结果有1例不正确,只鉴定到属;在61个野外分离株中,55株的芯片检测结果与生化或测序结果一致,有6例不一致,符合率为90%。初步研究证明,该检测方法能快速、有效地鉴定多种仔猪常见致病菌,但要区分某些细菌的致病株与非致病株,还要检测毒力/毒素基因。     

新城疫病毒传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒共检基因芯片的构建

本试验在前期研究的基础上,进一步构建了联合检测新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因芯片。克隆和鉴定了NDV-F、NDV-HN、IBV-M、IBV-N、ILTV-TK、ILTV-gB共6个基因,将其特异cDNA/DNA片段作为靶基因点制于氨基修饰的玻片上,制备了NDV-IBV-ILTV共检基因芯片阵列。以这3种病毒的核酸作为模板,引入Cy3-dCTP进行探针的PCR扩增标记,标记产物与芯片杂交,进行基因芯片的有效性评价,同时对该芯片的特异性、敏感性和稳定性进行了评价,并进行了临床初步检测验证。结果,确定了NDV-IBV-ILTV共检芯片的探针PCR扩增标记体系,确定Cy3-dCTP终浓度为100μmol/L;以禽流感病毒和传染性囊病病毒为模板制备的探针不与NDV-IBVILTV芯片杂交,NDV、IBV、ILTV之间无交叉反应;该芯片检测的灵敏度为20pg/μL;随机抽取3张不同批次制备的芯片,与NDV-F和NDV-HN的杂交结果显示,SNR均大于3。分别用该基因芯片和PCR/RTPCR检测了12份临床病料,结果显示,NDV检出率为16.67%,IBV检出率为41.67%,ILTV检出率为0,两者的检测结果一致。结果表明该检测技术能够用于NDV、IBV和ILTV快速诊断和临床病料的检测。     

霍乱弧菌三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种基于TaqMan探针法定量检测霍乱弧菌的三重荧光定量PCR方法,以霍乱弧菌种特异性基因ompW和毒力基因ctx、hly为靶基因,分别设计特异性引物及相应的TaqMan探针。在ompW、ctx、hly探针的5'端分别标记CY5、FAM、HEX荧光报告基团,3'端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示,本试验建立的三重荧光定量PCR方法与其他菌株无交叉反应,其最低检出限达到了10 CFU/m L,重复性试验中每组变异系数均小于1.4%;检测人工染菌的虾肉和贝类样品时,最低检出限也达到1×102CFU/m L。结果表明,本实验室建立的三重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,是高通量检测致病性霍乱弧菌的有效手段。     

山羊痘病毒及口疮病毒ITR-059基因双重PCR检测方法的建立

为实现山羊痘病毒(GTPV)和口疮病毒(ORFV)的同步快速检测,基于GTPV的ITR基因及ORFV的059基因,分别设计用于普通双重PCR的引物2对、用于二联实时荧光定量PCR的特异性引物及探针2套;探针分别用5′JOE-Eclipse3′及5′FAM-TAMRA3′荧光染料标记物进行标记。结果显示,所建立的GTPV-ITR-L-ORFV-059双重普通PCR方法,可实现对GTPV与ORFV的特异性双重检测,检测敏感度可达10~4copies/μL DNA;所建立的ITR-059二联探针实时荧光定量PCR方法可同时特异性检测ORFV和GTPV产生特异性荧光信号,二联探针的检测敏感度可分别达10~(2.87)和10~(2.52) copies/μL DNA。本研究初步建立了可同步特异性检测GTPV和ORFV的双重普通PCR及二联探针实时荧光定量PCR检测方法。     

山羊支原体山羊肺炎亚种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp),选择Mccp arc D基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立并优化反应体系,以Mccp和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为模板,进行普通PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR特异性检测,并对该方法的敏感性和重复性进行评估。同时利用该方法对68份山羊临床样本进行检测。结果显示,仅Mccp有扩增条带(185 bp)和明显的荧光扩增信号(Ct值为21.93),其余供试菌株没有扩增条带,且表现出微弱的荧光扩增信号(Ct值均大于31)。普通PCR检测的灵敏度为5.96×104copies/L,而TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的灵敏度为5.96 copies/L。Ct值在组内和组间重复的变异系数均小于1%。对68份山羊临床样本进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测,结果有2份为Mccp阳性样本,阳性率为2.94%。本研究建立了一种特异、敏感、稳定可靠的Mccp TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可用于Mccp的快速诊断和定量检测,为山羊传染性胸膜肺炎的防控提供了有效的技术手段。     

miRNA在鸡胚胎干细胞与鸡胚成纤维细胞中表达差异的研究

为筛选在鸡胚胎干细胞(c ESCs)和鸡胚成纤维细胞(CEFs)中差异表达的micro RNA(miRNA),并探讨miRNA在维持c ESCs多能性过程中的作用,分别体外培养c ESCs、CEFs,应用miRNA芯片检测c ESCs、CEFs的miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNA,并采用实时荧光定量PCR进行验证,同时利用生物信息学软件对靶基因进行预测。结果显示,从已知的993条鸡miRNA中,筛选出gga-miR-1777、gga-miR-302d、gga-miR-1607、gga-miR-1599和gga-miR-1576等19条在c ESCs中高水平表达的miRNA。实时荧光定量PCR检测结果显示,gga-miR-1777、gga-miR-302d的表达与miRNA芯片结果相符。生物信息学分析显示,gga-miR-1777、gga-miR-302d的靶基因中包含细胞分化相关的基因。研究结果提示,c ESCs中高水平表达的miRNA可能通过抑制分化基因的表达来维持c ESCs的多能性。     

布鲁氏菌全基因组DNA芯片研制及比较基因组杂交方法的建立

为利用布鲁氏菌强毒株马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)16M和流产布鲁氏菌(B.abortus)9-941全基因组序列,构建布鲁氏菌全基因组DNA芯片,并将其应用于比较基因组学分析,从基因库下载马耳他布鲁氏菌16M和流产布鲁氏菌9-941中的3 218个基因设计引物,经过条件优化和重新设计引物等方法进行大规模PCR扩增,成功扩增3 212条基因。产物纯化后点制醛基修饰玻片,每个基因2个点,加上阳性和阴性对照,芯片上合计6 912个探针。囊括了布鲁氏菌3 212条基因和阳性、阴性对照点。采用Cy3/Cy5双色荧光杂交技术,分别以马耳他布鲁氏菌16M和流产布鲁氏菌9-941作为参照和待测样本进行荧光双色杂交分析,成功建立了布鲁氏菌比较基因组杂交分析方法。若干质控杂交结果表明,建立的全基因组DNA芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。证明成功建立了基于全基因组DNA芯片的布鲁氏菌比较基因组学技术平台。     

泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为泛素基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中公布的泛素基因序列设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测泛素基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法的线性关系好,以质粒标准品构建的标准曲线的相关系数r~2为0.999;灵敏性、特异性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检测出不同类型细胞中泛素的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测泛素TaqMan实时荧光定量PCR方法。     

CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

为建立一种CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为CD63基因的动态检测提供有效的实验手段,根据GenBank中公布的CD63基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测CD63基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.997;灵敏性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检出不同类型细胞中CD63的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测CD63基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法。     

耐环丙沙星患病动物源沙门菌的多重耐药分子特征

采用13株耐环丙沙星食品动物源沙门菌进行喹诺酮类作用靶位基因及质粒介导耐药基因的扩增测序、有机溶剂耐受试验、HeLa细胞侵袭试验,探讨其多重耐药的分子特征。结果显示,菌株均携带质粒介导的喹诺酮耐药基因,7株对环丙沙星敏感性降低或低水平耐药(最小抑菌浓度0.125～4μg/mL),靶位基因无突变或gyrA单位点突变及外排泵活性增强;5株对环丙沙星高水平耐药(最小抑菌浓度32～128μg/mL),均在gyrA和parC发生双位点突变及外排泵活性增强,其中4株携带β内酰胺酶blaCTX-M基因。对环丙沙星高水平耐药的沙门菌的侵袭力显著高于敏感菌株。表明患病食品动物源沙门菌中,无论外排能力增强与否,gyrA单位点突变或质粒介导的喹诺酮耐药基因阳性,仅导致沙门菌对环丙沙星的低水平耐药;而外排泵机制联同染色体靶位基因突变可导致菌株对环丙沙星的高水平耐药,往往同时携带blaCTX-M基因;临床分离沙门菌随着对环丙沙星耐药程度的增加侵袭力增强。     

7种动物冠状病毒基因芯片同步检测的研究

根据发布的7种动物冠状病毒相关基因的序列,给每种病毒设计了4~17对引物,同时依据RNA聚合酶基因序列合成了1对兼并引物,利用TCV原毒和纯化浓缩的CCV、FCV、FIPV、TGEV、PRCV、BCV细胞毒,构建了89个基因片段的克隆。采用煮沸裂解法制备质粒DNA,进行特异引物PCR扩增,回收纯化产物,点制冠状病毒基因芯片。抽提病毒总RNA,利用Cy3-dCTP随机渗入反转录PCR标记,同时对BCV、CCV利用Cy3-dCTP随机渗入反转录标记,与芯片进行杂交检测。结果显示,BCV和TCV基因克隆间未见交叉,CCV、FCV、FIPV、TGEV、PRCV则存在广泛交叉。选择无交叉的特异克隆片段点制最终基因芯片,并与病毒多重PCR扩增产物杂交,芯片信号未见交叉,结果判断明确。表明,基因芯片检测法比传统PCR法敏感1 000倍。     

不同动物源性大肠杆菌多重耐药调控基因rob的同源性分析

为研究大肠杆菌多重耐药调控基因rob与不同动物源性及多重耐药水平之间的关系,选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌5株及大肠杆菌药敏质控株ATCC25922,在对其进行主要治疗药物耐药性检测的基础上,分别以其染色体DNA为模板,通过PCR反应扩增出大肠杆菌多重耐药调控基因rob,将该基因分别与克隆载体pMD18-T连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,对经酶切与PCR反应鉴定为阳性的克隆质粒进行了核苷酸序列测定。测序结果表明:不同动物源性大肠杆菌的rob基因与Gen-Bank中该基因的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列的同源性较高。不同源性大肠杆菌的rob基因的核苷酸序列与其动物源性有关,该基因的核苷酸序列的个别突变位点可能影响AcrAB外输泵的表达水平,进而影响其多重耐药水平。     

天祝白牦牛MSTN基因第3外显子的多态性分析

为分析天祝白牦牛MSTN基因第3外显子的遗传多态性及变异特征,采用PCR-SSCP方法检测了698头天祝白牦牛MSTN基因第3外显子的多态性,对群体内各等位基因进行了克隆、测序。结果显示,天祝白牦牛MSTN基因第3外显子有AA、AB和BB 3种基因型,其基因型频率分别为0.892 6、0.106 0和0.001 4,由A和B 2个等位基因控制。序列分析表明,天祝白牦牛MSTN基因第3外显子在41bp处发生了A→G突变,但并未导致编码氨基酸序列发生改变。统计结果表明,天祝白牦牛MSTN基因第3外显子呈低度多态。     

H1N1和H3N2亚型流感病毒基因芯片检测方法的建立

为建立同时能鉴别甲型H1N1和猪流感病毒常见亚型的新型基因芯片检测方法,根据GenBank中已发表的甲型流感病毒MP的基因序列和甲型H1N1(2009)和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型的基因序列,设计、筛选并合成7对特异性引物和1对通用引物;根据扩增的靶序列,设计并合成14条特异性探针和3条质控探针,制备了甲型H1N1(2009)流感病毒和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型基因芯片;并进行了特异性试验、敏感性试验和田间样品的检测。结果显示,该芯片检测方法与猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病毒无交叉反应;对猪H1N1、猪H3N2和甲型H1N1(2009)流感病毒而言,最低可检测到105、104和105稀释的病毒株。结果证实,该方法特异性强、敏感性高,是一种高通量的甲型H1N1和猪流感常见亚型筛查方法。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了 1对PCR引物 ,以伪狂犬病病毒Ea株 (pseudorabiesvirusEa ,PRVEa)基因组DNA为模板 ,扩增出一大小为 5 11bp的片段。通过酶切和测序证实 ,该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因 ,即gL基因。Blast软件分析表明 ,该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为 94% ,氨基酸序列的同源性为 95 %。将测序结果输入GenBank ,获得登录号AF44 845 6。     

口蹄疫病毒全长cDNA克隆的快速构建

利用RT PCR和 3′cDNA末端快速扩增 (RACE)技术分别扩增出包含口蹄疫病毒(FMDV)全基因组的 2个重叠cDNA片段 ,将其分别插入到载体 pcDNA3.1zeo( )和pGEM T Easy中 ,然后利用片段本身单一酶切位点将FMDV全长cDNA克隆至 pcDNA3.1zeo( )载体 ,经PCR扩增、酶切鉴定和序列测定。结果表明 ,重组质粒 (pcDNA3.1/FMDV)携带了FMDVOH/99基因组全长cDNA序列