貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

猪传染性胃肠炎病毒SY株的分离鉴定及S基因的序列分析

取沈阳地区某猪场表现为腹泻症状的病死仔猪小肠病料,无菌处理后接种在PK-15细胞上分离病毒。通过无限稀释法进行病毒纯化、病毒中和试验和RT-PCR检测,证实其为传染性胃肠炎病毒(TGEV),并命名为TGEV SY株。参照Gen Bank中TGEV序列设计引物,对SY株S基因进行RT-PCR扩增,克隆并测序,获得S基因组完全序列。将S基因序列和所编码的氨基酸序列与Gen Bank中登录的10个TGEV和1个PRCV S基因序列进行同源性和亲缘关系的比较分析。结果表明,SY株S基因核苷酸序列和编码的氨基酸序列与其他参考毒株的同源性分别为96.4%~99.2%和96.0%~97.9%;而与PRCV毒株的同源性分别为96.2%和96.6%。由系统进化树可知,SY株与国内的华毒株、TS株以及国外的Miller M60株位于进化树的同一分支,亲缘关系较近。总体来看,各毒株之间的S基因差异性不大,表明TGEV虽然处于不断遗传演化中,但不同毒株的S基因变异不是特别明显。     

牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-LN01/08株的分离鉴定

从辽宁省某牛场出现疑似牛传染性鼻气管炎症状的牛鼻拭子样品中分离出一株病毒,该病毒能在MDBK细胞上增殖,能产生牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)典型性细胞病变。通过间接免疫荧光试验、微量血清中和试验、PCR及病毒形态学观察鉴定,证明该分离毒株为IBRV,并被命名为IBRV-LN01/08。根据IBRV的保守区核苷酸序列设计了1对鉴定引物,将扩增的目的片段进行克隆、测序及序列分析。结果表明,该片段序列与GenBank上登录的IBRV K22株的同源性为99.9%。动物回归试验结果显示,6~9月龄IBRV抗体阴性黄牛人工感染IBRV-LN01/08株F3代细胞培养物后,试验动物出现持续体温升高,流鼻涕,鼻内黏膜有白色糜烂溃疡及结节等牛传染性鼻气管炎的临床症状,表明该毒株具有一定的致病性。     

猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的扩增与克隆

应用RT PCR方法扩增出猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的核衣壳蛋白基因 (N基因 ) ,并将其克隆到 pET 32a载体 ,构建了高效原核表达载体pETN。将 pETN重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌后 ,对插入片段进行了序列测定及同源性分析。结果表明 ,插入片段序列与PRRSV美洲型ATCCVR2 332株的ORF7核苷酸序列同源性达 99.9% ,与分离毒株的同源性达 99.0 %。     

口疮病毒XC13株的分离鉴定

采用MDBK细胞对西昌市某山羊场疑似患有口疮的山羊病料进行分离培养,经动物回归试验、PCR、遗传进化分析等对分离毒株进行鉴定。结果表明,病料在MDBK细胞上产生致细胞病变;接种病料的山羊出现典型的传染性脓疱;PCR从分离毒株中扩增出F1L基因片段,该基因片段序列与口疮病毒(ORFV)参考株FJ-SL2、FJ-SL1的核苷酸序列的同源性分别为99.8%、99.5%,亲缘关系较近,遗传进化分析处于同一分支上。本研究从疑似口疮病料中成功分离鉴定出1株口疮病毒,遂将其命名为ORFV XC13。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。     

猪伪狂犬病病毒MQ18变异株的分离鉴定

为了解福建省猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的病原学特性及分子遗传变异情况,本研究用羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)从疑似暴发伪狂犬病猪场死亡的育肥猪中分离到1株病毒,该病毒能够产生典型的PRV细胞病变,病毒液接种小鼠(0.1 mL/只)及成年兔(0.5 mL/只)在48～60 h死亡,均表现出典型的伪狂犬病症状。经PCR试验、电镜观察及特异性血清间接免疫荧光试验鉴定为伪狂犬病病毒,命名为MQ18株;并对其进行病毒效价的测定及gC、gE基因核苷酸和氨基酸序列差异性分析。结果显示,分离株TCID50为10~(-7.71)/0.1 mL;将其gC和gE基因序列与国内外17个PRV参考毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性分别为93.5%～99.9%和97.8%～100%,氨基酸序列同源性分别为88.7%～99.8%和95.7%～100%;分子遗传进化树分析显示,gC和gE基因均与国内近6年分离的PRV变异株集聚在一起,属于同一个进化分支;与经典株相比,gC基因编码的氨基酸序列在第63～69位有1个AAASTPA的连续7个氨基酸插入,gE基因编码的氨基酸序列分别在第48位和第496位有1个天冬氨酸(D)的插入,与PRV变异株变异位点相一致。以上结果证实,从发病猪群中分离到1株PRV变异株,本研究结果为选择合适疫苗来防控猪伪狂犬病以及病原学研究提供了参考。     

猪传染性胃肠炎病毒HN-2012分离株S基因的遗传变异分析及其真核表达

以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)HN-2012株的cDNA为模板,经克隆测序后,将得到的S基因序列及其推导的氨基酸序列与NCBI中不同来源的TGEV毒株的相应序列进行同源性和亲缘关系的比较分析,构建系统进化树进行遗传变异分析;然后将S基因亚克隆至真核表达载体pCAGGS-S-flag中,转染293T细胞进行表达,利用flag标签抗体进行Western-blot分析。结果显示,TGEV HN-2012株的S基因与其他毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.1%~99.1%和93.6%~95.2%,与H株的亲缘关系较近,与我国其他毒株的亲缘关系较远。Western-blot分析中可见大小约为160ku的目的条带,表明S基因成功在293T细胞中表达。本试验结果为深入研究TGEV S蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定及其E基因分析

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测猪流产胎儿病料中的乙型脑炎病毒(JEV),并对阳性病料做病毒分离与纯化.通过空斑减数试验测定了分离株和JEV P3株的中和指数.对分离株的prM-E基因进行克隆并测序,将推导的E蛋白序列与GenBank中登录的JEV毒株的E蛋白序列做比较分析.以E基因序列为基础,绘制进化树.结果显示,在检测的9份病料中有3份呈JEV阳性,并分离出1株JEV,命名为HEN0701.经测定,P3株的中和指数为12,分离株的中和指数为2.prM与E基因的序列分析表明,分离株与P3和Beijing-1株的同源性较低,最高仅为87.7%;而与JEV/sw/Mie/40/2004、KV1899、SH17M-07和YN79-Bao83株的同源性较高,最低为96.6%.进化分析表明,分离株属基因Ⅰ型.E蛋白序列分析结果显示,分离株与基因Ⅰ型JEV的E蛋白序列高度同源,且与SH-53、JEV/sw/Mie/40/2004和VN22/Viet Nam/2002/swine blood株的E蛋白序列完全相同,而与基因Ⅲ型JEV的E蛋白序列存在4个共同的氨基酸变异位点.     

口疮病毒四川流行株的分离鉴定及其遗传进化分析

为了解四川地区口疮病毒(ORFV)流行毒株的遗传变异情况,从当地4个黑山羊养殖场采集疑似ORFV感染的羔羊唇部结痂组织,通过MDBK细胞分离培养、PCR、病毒效价测定、间接免疫荧光试验等方法进行分离鉴定,并对分离毒株的保护性抗原基因B2L、F1L进行克隆与序列分析。结果表明,成功分离到4株ORFV,并将其分别命名为SC-LZ1、SC-LZ2、SC-PZH1、SC-PZH2。序列分析结果显示,这4株分离毒株保护性抗原基因B2L、F1L相对保守,其B2L、F1L基因编码的氨基酸序列与参考株的同源性分别为96.3%～100%和94.2%～100%。本研究为四川地区羊口疮的防制奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒鸡源分离株的鉴定与人工感染试验

从临床患病鸡关节病料中分离到一株病毒,在电镜下观察到病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,外衣壳直径约75 nm,内核约50 nm;分离病毒株对酸、热有较强的抵抗力,对乙醚不敏感;病毒感染鸡胚成纤维细胞上能产生以融合细胞为特征的CPE;爪垫接种1日龄雏鸡表现出明显的病毒性关节炎临床症状,并伴有吸收障碍型和坏死型的病理变化;血清中和交叉试验表明,该病毒分离株与国内的2株番鸭源呼肠孤病毒(YH和YB)分离株和国外S1133呈不同程度的交叉反应。通过对分离病毒株进行电镜观察、理化特性试验、病毒感染力测定、致病性试验、血清学试验,可以确定该分离病毒为禽呼肠孤病毒。     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙古株的分离与观察

以内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺组织 4例和 3月龄绵羊胎肺 2例作为材料 ,对胎肺细胞进行了原代培养并接种绵羊肺腺瘤病毒悬液 ,进行了绵羊肺腺瘤病毒 (JSRV)的分离 ,同时采用电镜负染色技术和超薄切片透射电镜技术对上述样品进行了观察。结果表明 ,自然感染绵羊肺腺瘤病的 4例病肺组织中都有散在的病毒粒子 ,其直径为 10 0～ 12 5nm ,接种病毒悬液的胎肺细胞从第 2代到第 9代均出现细胞病变 ,但对绵羊胎肺培养的病毒悬液电镜负染色观察未发现典型的病毒粒子 ,而超薄切片透射电镜观察发现了病毒样粒子     

水貂肠炎病毒疫苗株和野毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立

为了建立水貂肠炎病毒(MEV)疫苗株与野毒株的鉴别检测方法,根据GenBank中的水貂肠炎病毒序列设计了1对引物,用来扩增包含水貂肠炎病毒NS1基因在内的2 013bp大小的片段。通过对国内疫苗毒MEVB株及其他细小病毒参考株的NS1基因序列比较发现,疫苗毒MEVB株NS1基因核苷酸1401位的碱基由T变为C,致使1399位～1404位的核苷酸构成由ATTGAT变异为ATCGAT,多了1个限制性内切酶ClaⅠ酶切位点,其他MEV分离毒株中均未出现此酶切位点。用特异性引物扩增出2 013bp的目的片段后,再用限制性内切酶ClaⅠ进行酶切分析,疫苗毒MEVB株被切割成1 404bp和609bp的2个片段,国内其他分离株均未出现上述片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗毒MEVB株和野毒株。     

一株犬型钩端螺旋体的分离与鉴定

钩端螺旋体病是由问号钩端螺旋体引起的一种人兽共患病,在世界上分布较广。人主要是通过间接接触被带菌动物如野鼠、家畜等尿液污染的水、土壤而感染本病,也有在畜牧养殖、屠宰、加工过程中直接接触病原体而被感染的。钩端螺旋体病的临床症状轻重不一,早期主要表现为发热,眼结膜充血,肌肉疼痛、乏力,腓肠肌压痛,浅表淋巴结肿胀;后期表现为皮肤、脏器广泛性出血,肝、肾功能障碍等。我国是受钩端螺旋体病危害较严重的国家,本病对人类的健康带来了危害,也给畜牧业造成了一定程度的经济损失,同时在养犬业和军警犬中也有暴发流行。笔者曾对送检的…     

鸭黄病毒AH01株的分离与鉴定

为查明2010年10月以来安徽望江等地的蛋鸭相继暴发的以产蛋量大幅下降为特征的传染病的病因,进行了病毒分离、特异性目的基因片段扩增和动物回归试验。结果显示,分离毒(命名为AH01株)能致死鸭胚和鸡胚,不具有血凝性。对病料和接毒鸭胚尿囊液进行RT-PCR,可扩增出基因片段,其核苷酸序列与鸭黄病毒BYD-1株的相似性为94.1%。用鸭胚分离毒接种300日龄蛋鸭,能够复制出产蛋量下降病例。分析表明,分离毒为鸭黄病毒,该病毒是引起此次鸭病疫情的病原。     

猪生殖与呼吸综合征病毒NX/ZhW/07株的分离鉴定及其ORF5、Nsp2基因特性分析

将2007年宁夏送检的疑似猪高热病病料处理后接种于Marc-145细胞,结果Marc-145细胞出现典型的细胞病变,应用猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,将其命名为NX/Zhw/07.采用RT-PCR方法扩增该分离株的ORF5和Nsp2基因,并进行序列分析.结果表明,NX/ZhW/07株的ORF5基因与GXHP-5、Hainan-1、HUBl、Hunan-1、JIANGSU、Jiangxi-1、LN-5和SHH-5株的核苷酸序列的同源性分别为92%～94%,其中与CH-la株的核苷酸序列的同源性最高,达99.2%.Nsp2基因序列分析显示,出现30个氨基酸的不连续缺失,与国内高热病分离株JXA1的缺失位置完全一致.由此推测NX/ZhW/07株属于PRRSV美洲型变异株.     

猪传染性胃肠炎病毒国内分离株S基因克隆及与国外分离株的同源性比较

用猪睾丸细胞增殖并扩增猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)国内分离株TH 98,根据基因库中已发表的TGEVS基因cDNA序列 ,利用Oligo软件设计并合成 2对引物 ,进行逆转录聚合酶链反应 (RT PCR) ,扩增出 2 .3kb和 2 .1kb2个片段 ,即Sa与Sb。将Sa与Sb先后插入到pUC18质粒载体上的EcoRⅠ和PstⅠ多克隆位点上 ,构建了重组质粒pUC S。根据TGEVS基因位点和 pUC18的物理图谱 ,用相应的限制性内切酶进行酶切及套式PCR方法鉴定、分析 ,证明克隆的pUC S为TGEVS基因。同时对pUC S进行序列测定分析 ,并与来自美国、英国和日本的 5个毒株进行核苷酸及编码氨基酸同源性比较 ,证明了S基因的高度保守性     

猪瘟病毒GSLZ株的分离与鉴定

采集甘肃省兰州市某猪场疑似猪瘟样品,将RT-PCR检测为阳性的样品处理后接种PK-15细胞并盲传至第12代,结果在盲传2代之后的细胞培养物中均可检测到猪瘟病毒(CSFV)E2基因.经浓缩、纯化的病毒在电镜下呈约25 nm典型的CSFV病毒粒子,将其命名为GSLZ株.对E2基因核苷酸序列的分析显示,该分离株与标准参考毒株...     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

J亚群禽白血病病毒膜表面糖蛋白基因gp85的克隆与表达

以pGEM IMC2 .2 重组质粒为模板扩增禽白血病病毒内蒙株IMC10 2 0 0 gp85基因 ,构建了转移载体pFastBacl IMCgp85 ,并利用Bac to Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac IMCgp85。转染Sf 9细胞后的表达研究表明 ,重组杆状病毒可高效表达IMC10 2 0 0 的gp85基因 ,表达产物具有病毒的抗原特异性 ,与ALV J单抗JE 9有强的间接免疫荧光反应。蛋白质印迹法分析表明 ,表达产物的分子质量约 5 4ku。