利用峰面积分析混合DNA样品

在法医DNA检验过程中 ,经常会遇到多个体的混合样本 ,如受害人和嫌疑人的混合样品 ,几个嫌疑人的混合样品。荧光标记自动分析STR系统 ,不仅能根据位点等位基因的个数判断样品是否为混合样品 ,而且还能根据等位基因峰面积 (谱带荧光总强度 )确定混合样品中各组分的混合比例 ,推断混合样品中各组分的基因分型[1] 。Gill等建立了利用峰面积分析混合样品的方法[2 ] 。本文利用该法对一宗案件中的混合样品进行了分析 ,推断混合样品各组分的比例及各组分的基因分型。材料和方法2 0 0 1年于中山某地发生一宗强奸案 ,送检材料为事主血纱 ,嫌疑人 …     

二组分混合DNA样品STR图谱解释

对混合样品STR图谱的结果进行解释。实验模拟二组分DNA混合样品 ,复合扩增荧光检测 10个基因座 ,比较混合样品谱带 ,计算等位基因峰面积比。结果发现 :二组分DNA混合样品的等位基因数增加 ,样品的混合比例不同就出现峰面积的不平衡。在等位基因峰面积比值与样品组分混合比例接近时 ,可由峰面积比值推断混合样品的混合比例。在混合比例为 1∶2 0时 ,基本上检测不到来自少量混合成分的等位基因 ,表现为单一组分图谱 ;在混合比例为 1∶10时 ,含量低的组分的等位基因峰面积接近与主要组分的“Stutter”峰面积 ,与来自主要组分的等位基因峰面积差异很明显。能检出混合样品中少量成分等位基因的最高混合比例为 1∶10     

四类遗传标记的检测用于混合精斑的个人识别

目的探讨综合应用常染色体STR与Y-STR、X-STR、mtDNA高变区Ⅰ序列检测四类遗传标记,提高两男性混合精液样品的个人识别率。方法使用商品化试剂盒检测混合精液样品的常染色体与X、Y染色体STR,应用单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)法分离两男性混合精液样品的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)高变区Ⅰ序列,并进行序列分析。结果混合精液样品比例超过1:10(高组分所占比例继续增加而低组分所占比例继续减少)时可以确定高拷贝者的全部四类遗传标记系统的分型。比例接近时,通过与嫌疑人检测结果的比较可获得排除或基本认定的意见。结论四类遗传标记系统的联合检测有助于提高两男性混合精液样品的个人识别率。     

混合生物样品的组分分析及其STR基因型判定

目的应用荧光标记STR多基因座联合检测技术对混合生物样品较少组分最低比例检出限和STR基因型的判定进行研究。方法 将已知浓度的人标准细胞系DNA:9947A和K562分别按照1:1、1:4、1:9、1:19、1:39、1:59、1:79和1:99比例混合后作为扩增模板,应用Profiler plus试剂盒对D3S1358、VWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820和性别鉴定基因座检验。结果在比例为1:19时能明确判定两个体各基因座基因型,且两样品基因型结果峰高平均值之比与样品浓度之比正相关。结论应用荧光标记STR多基因座联合检测技术可以对一定比例的混合生物样品进行STR基因型判定,并对其混合比例状况进行大致推断。     

浅析混合样品荧光STR图谱的个体分离

在日常案件DNA检验过程中,经常会遇见两个或多个个体混合在一起的STR图谱.迄今为止,多人份样品混合后确定各个体基因型仍为法医DNA检验的难题.作者通过对荧光STR图谱中各峰值进行定量分析研究,在已知一个体STR分型的前提下,确定两个体混合样品(下文中所述混合样品均指两个体的混合样品)荧光STR图谱中另一个体的STR分型进行浅析,现报道如下:     

寡核苷酸芯片技术在HLA-A抗原基因分型中的应用研究

目的建立一种HLA-A位点的基因芯片分型方法,为HLA-A位点的基因分型提供一个较新的思路。方法利用基因芯片技术,根据HLA-A位点不同基因亚型的独特序列设计探针,制成分型芯片;待检测样品经PCR反应标记上荧光之后,与芯片进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值分析确定样品HLA-A位点的基因亚型。将这一方法应用于100份标准DNA和200份无关个体的HLA-A位点基因分型并将部分样品进行测序。结果检测结果表明HLA-A基因分型芯片可准确分辨出A位点等位基因20大类,耗时2.5h。结论寡核苷酸芯片技术用于HLA-A基因分型,分辨率高、特异性强、重复性好、操作简便、结果直观,适合于法医学实践和临床应用。     

光谱校准异常导致STR分型误判1例

目前基于多色荧光识别复合扩增的STR分型是法医DNA分析的主要方法。Applied Biosystems（ABI）公司的遗传分析仪是现今国内法医学实验室STR分型的常用检测仪器。检测时扩增产物经过毛细管电泳后,通过进行多种荧光成分的分析计算来完成不同荧光标记的STR基因座的区分和判型。在数据分析中如果荧光信号过强,其光谱校准的去颜色叠加不能正常工作,就会使分析困难甚至导致分型错误。作者在实际检案中发现1例由于荧光信号过强,同时D3S1358基因座的等位基因出峰位置与D19S433基因座的等位基因出峰位置重叠,     

2个miniSTR等位基因分型标准物的制备

目的采用分子克隆技术制备miniSTR D3S4529和D12ATA63基因座等位基因分型标准物,并评价其应用价值。方法用荧光引物对835份无关个体血卡样本进行扩增并分型检测,筛选2个基因座的等位基因片段,用分子克隆方法制备等位基因分型标准物,并对中国汉族群体进行遗传学调查。结果根据筛选出的等位基因片段制备出分型标准物,各等位基因峰形尖锐,无双肩峰,峰高基本一致,荧光值在4 000 RFU左右。中国汉族人群D3S4529、D12ATA63基因座分别检出7个、11个等位基因,杂合度分别为0.752、0.723,多态信息含量均为0.71。结论通过分子克隆法制备的miniSTR D3S4529和D12ATA63等位基因分型标准物,在法医学研究中具有较高的应用价值。     

HLA-DRBl基因分型芯片的法医物证学应用价值研究

目的对HLA-DRBl基因分型芯片在个体识别中的应用价值进行研究。方法根据HLA-DRBl基因座不同等位基因的独特序列设计探针．制成分型芯片。将待测样品DNA用末端标记了CY5的引物进行PCR扩增，产物与芯片进行杂交．根据杂交产生的荧光信号值确定样品在HLA-DRB1位点的基因型。将这一方法应用于561份样本的HLA-DFIBl基因分型，根据基因型分布统计分析其法医学应用价值。同时．进行了家系调查和方法灵敏度分析，并应用于部分案例。结果利用微量检材．HLA-DRB1基因芯片可检测DRB1位点等位基因26个，基因型的分布符合Harely—Weinberg平衡定律．该位点的观察杂合度(Ho)为0．888，期望杂合度(He)为0．902，多态信息含量(PIC)为0．893，平均非父排除率(PE)为0．80l。家系调查和案例运用的结果表明，HLA-DRB1位点等位基因由亲代向子代的传递符合盂德尔遗传定律。结论HLA-DRB1为高度多态位点，其基因分型芯片可在亲子鉴定和个体识别中发挥重要作用。     

法医DNA分析的其他应用

综述了法医DNA的多种用途,如人死后根据体内DNA变化情况推断死后时间间隔,利用线粒体DNA4977bp的缺失以及端粒的长度推断年龄;利用昆虫mtDNA的细胞色素氧化酶亚基I进行昆虫种属鉴定,以帮助确定人的腐尸死亡时间;利用一些食血昆虫体内的人DNA帮助了解与案件的关系;利用DNA标记进行动物如犬、牛、马及猪等个体识别与亲子鉴定,解决因动物引起的纠纷,或者利用DNA分析嫌疑人周围的动物毛发、植物及土壤微生物等,确定嫌疑人与案件的关系。     

HLA-DRB1基因分型芯片的法医物证学应用价值研究

目的对HLA-DRB1基因分型芯片在个体识别中的应用价值进行研究。方法根据HLA-DRB1基因座不同等位基因的独特序列设计探针,制成分型芯片。将待测样品DNA用末端标记了CY5的引物进行PCR扩增,产物与芯片进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值确定样品在HLA-DRB1位点的基因型。将这一方法应用于561份样本的HLA-DRB1基因分型,根据基因型分布统计分析其法医学应用价值。同时,进行了家系调查和方法灵敏度分析,并应用于部分案例。结果利用微量检材,HLA-DRB1基因芯片可检测DRB1位点等位基因26个,基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,该位点的观察杂合度(Ho)为0.888,期望杂合度(He)为0.902,多态信息含量(PIC)为0.893,平均非父排除率(PE)为0.801。家系调查和案例运用的结果表明,HLA-DRB1位点等位基因由亲代向子代的传递符合孟德尔遗传定律。结论HLA-DRB1为高度多态位点,其基因分型芯片可在亲子鉴定和个体识别中发挥重要作用。     

荧光标记复合扩增毛细管电泳法在SNP分型中的应用

目的采用荧光标记复合扩增毛细管电泳法，对辽南地区汉族人群13个SNP进行等位基因频率调查，并评价其法医学应用价值。方法选择13个双等位基因SNP，应用荧光标记片段长度差异等位基因特异性复合扩增SNP分型方法，对辽南地区汉族人群进行群体调查。结果每个SNP纯合子为单一产物峰，杂合子则为长度不同的两个产物峰。不同位点扩增产物长度不同，根据产物长度和产物峰数量进行SNP分型，其结果与直接测序完全一致。同时获得辽南地区汉族人群13个SNP等位基因频率。结论采用荧光标记复合扩增毛细管电泳法进行SNP分型，方法简单实用，在法医学个人识别领域具有较高的应用。     

运用二重PCR和DNA芯片技术检测ABO基因型

目的以玻片为载体,用寡核苷酸探针杂交技术检测ABO基因型。方法根据ABO基因座外显子6和外显子7的3个SNP点的序列分布特征设计4条寡核苷酸探针,制成分型芯片。将待测样品DNA用末端标记了Cy5的引物进行二重PCR扩增,产物与芯片上的探针进行杂交,根据杂交产生的荧光信号确定样品的ABO基因型。结果利用ABO芯片,可对血斑、毛发等微量检材进行ABO基因型检测。对115名汉族无关个体的调查表明,ABO基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡,等位基因杂合度观察值和期望值分别为0.591、0.616,多态信息含量为0.544,二联体和三联体非父排除率分别为0.188、0.334,个体识别能力为0.777。结论通过DNA芯片检测ABO基因型的技术适用于法医学样本,可满足高通量的检测需求。     

STR图谱分析中的问题及对策

STR图谱分析是STR检验的最后一步,对STR图谱正确分析解读会影响并决定数据的有效性。在STR图谱分型中常见的影响因素有以下几种：出现OL峰,其常见原因有稀有等位基因、电泳漂移、pullup峰、染料峰、荧光污染峰等;出现微量DNA致等位基因丢失,需要多次扩增或浓缩后扩增来帮助判断等位基因的个数;出现引物结合区的变异致无效等位基因,可以通过不同试剂盒的扩增来纠正[1];出现三等位基因,常见的原因有疾病或体细胞突变,疾病会致染色体和基因的复制影响到个体的所有细胞,     

云算GPM混合图谱分析系统在混合样本检验中的应用

目的 运用云算GPM混合图谱分析系统拆分混合样本的DNA图谱,探究该检测系统的去卷积能力。方法 通过检测13例混合样本的基因分型,统计其经云算GPM系统去卷积后的各基因座分型结果。结果 所有混合图谱均得到有效拆分,主要贡献者的分型准确率（93.04%）高于次要贡献者（50.48%）。包括Amel、D7S820和TH01在内的12个基因座分型准确性较高,提示其可作为嫌疑人排查的优先选择。weight（权重）值大于90%的基因座分型准确率高达99.63%,分型结果完全正确的基因座平均weight值为82.36%±24.68%,表明虽然weight值是判断分型可靠性的有效指标,但该阈值并非是正确分型的充分或必要条件。结论 云算GPM混合图谱分析系统对混合样本的去卷积有一定的指导作用,但其分型结果的准确性仍有待进一步提高。     

多重置换扩增技术用于法医学微量DNA检测效果

目的探讨多重置换扩增（MDA）技术对法医学微量DNA样品STR检测分型的效果。方法用MDA技术对不同模板量DNA进行全基因组扩增（WGA）．扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用Prrfiler Plus^TM试剂盒检测基因型。结果该方法可对模板DNA增加10^4～10^6倍。1ng样品DNA的MDA产物可获得9个STR基因座和Amelogenin性别基因座的准确分型结果；低于0．1ng的样品DNA经MDA扩增后，基因座检出数增加。但可见等位基因不平衡或丢失现象。结论MDA技术可有效增加DNA模板量和提高微量DNA分型效果。但样品DNA量低于0．1ng时，MDA产物的STR分型结果判读须慎重。     

基于等位基因特异性PCR原理建立的SNP分型新方法

目的建立一种新方法,对多个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点进行分型。方法基于等位基因特异性PCR原理,采用荧光标记复合扩增和毛细管电泳技术,根据PCR片段长度差异进行分型。选择SNP位点共11个,每个SNP位点设计两条长度不同、3’末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上游引物,同时为了增加特异性,在两条等位基因上游引物的3’末端第3或第4位碱基人为引入错配。在距离上游引物100～300bp范围内的合适位置,设计下游共用引物,并进行荧光标记。所有位点经过复合扩增后,PCR产物经ABIPrismTM310型遗传分析仪电泳分离,确定每个SNP的基因型。结果每个SNP位点纯合子为单一产物峰,杂合子则为长度不同的两个产物峰。不同的SNP位点扩增产物长度不同,根据产物长度和产物峰的数量进行SNP分型,一次完成11个SNP位点分型,其结果与直接测序完全一致。结论荧光标记复合扩增片段长度差异等位基因特异性PCR法是一种简单快速而有效的SNP分型新方法。     

单细胞分离荧光原位杂交法用于男女混合血DNA分型

目的采用单细胞分离荧光原位杂交法精确分离混合血样中男性和女性细胞并进行分型检验。方法收集男、女性血,按照男∶女为1∶5、1∶10、1∶20制备混合血样,加入0.075mol/L KCl 600μL,轻混、放置30min后加入150μL固定液离心留沉淀涂片,利用Vysis 30-161050试剂盒进行荧光原位杂交,并用PALM激光显微捕获系统分离出男、女性细胞,使用Identifiler试剂盒复合扩增并进行检测。结果捕获8个血细胞即可得到完整的DNA分型,且随着细胞数目的增多,检出率逐渐提高而等位基因丢失率逐渐降低。10个血细胞的检出率最高,为93.75%。5μL男性血液与本实验各比例女性血混合用本文方法检验均可获得男性分型。案例混合血斑经检验获得单一男性和女性分型。结论单细胞分离荧光原位杂交法可用于男女混合血样本中DNA分型检验。     

荧光标记STR复合扩增检验系统的研究

本研究以化学合成的荧光标记引物建立了STR复合扩增体系,体系I包括4个STR基因座和牙釉蛋白基因,体系Ⅱ包括4个STR基因座,体系Ⅲ包括3个STR基因座.制备了体系I各基因座的等位基因标准对照,测定了各等位基因长度.对代表性等位基因进行了序列测定,确定了等位基因重复单位的重复数目及测量长度与等位基因命名的对应关系,对各基因座等位基因进行了标准命名.建立了复合扩增检验系统等位基因自动分析命名的模板.三个复合扩增检验体系的累积随机匹配概率为8.3×10-3,为遗传学分析建立了实用的检验系统.     

用PCR技术串并系列轮奸案

1 案例资料1998年11月14日,广州某郊市一发廊发生一起入屋抢劫轮奸案.案发后当地警方先后送检了受害者梁某、沈某的阴道拭子和血纱,以及7名嫌疑人的血.提取梁某、沈某阴道拭子上的精子DNA和受害人、嫌疑人血DNA,用荧光标记复合扩增STR试剂盒Amp Fi STR Profiler Plus Amplification Kit(美国PE公司),用PE377全自动测序仪电泳检测分析(操作方法按文献),证实梁某阴道拭子上含有1人精斑,沈某阴道拭子上含有至少2人的混合精斑,同时排除了7名嫌疑人.1999年5月25日,该郊市另一发廊又发生一起入屋抢劫轮奸案,事后当地警方很快送检了受害者谭某的阴道拭子和血纱,以及3名嫌疑人的血.提取谭某阴道拭子上的精子DNA和受害人、嫌疑人血DNA,用上述拭剂盒扩增,经检测分析各样品的基因型,发现谭某阴道拭子上含有至少2人的混合精斑,但排除含