用超低温冷冻技术保存猪瘟弱毒毒种的有效期

猪瘟兔化弱毒毒种(下称猪瘟毒种)的保存,按农牧渔业部1979年11月修订《猪瘟兔化弱毒湿苗的制造、检验及应用方法》规定(下称规程),试验室保存新鲜脾、淋组织,在0～4℃保存不得超14天,猪瘟毒种14天继代一次,并应经常冷藏保存数代新鲜含毒脾、淋组织,如经过保存的毒种接种家兔后产生的热反应不明显时,应连续通过兔体继代,至有定型热产生为止。这样浪费家兔多,生产成本高,操作层次多,工作效率低。从1981年开始,用液氮超低温(—195.8℃)冷冻     

牛O型口蹄疫灭活苗制苗毒种的稳定性及其免疫原性监测

用Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ法测定牛Ｏ型口蹄疫（ＦＭＤ）制苗毒种ＯＡ／５８（Ｆ４９／９１）对牛的半数最小感染量（ＭＩＤ＿（５０））为１０￣（－８．７７）／０．１ｍｌ，与ＯＡ／５８（Ｆ３０／６６）一致，表明毒种对一的毒力稳定。毒种适应制苗细胞ＢＨＫ—２１单层在７～２０代内收获的细胞毒具有稳定的蚀斑特性和感染性滴度。不同代数病毒（Ｆ１０、Ｆ１５、Ｆ２０）蚀斑克隆株的大斑、小斑株按疫苗制造与检验试行规程制成双相油佐剂疫苗免疫豚鼠，２８天后用强毒攻击，结呆Ｆ１０６／８保护，Ｆ１５６／８保护，Ｆ２０７／８保护，证明在试验代数内制苗毒种对豚鼠具有良好、稳定的免疫原性。对强毒攻击７天后的豚鼠血清中和抗体分析表明，此时血清中和效价与免疫豚鼠抗强毒感染的保护性之间无对应关系。     

口蹄疫A型细胞组织培养弱毒疫苗、细胞组织培养兔体反应弱毒疫苗的研究——1972年工作总结

对6个半月～7个月及8个半月的免疫持续期试验,我们采用仔猪肾上皮细胞毒120代(病毒滴度=10~(-7.5))又连续适应3～4日龄乳兔三代,乳兔在接种后36～40小时出现典型口蹄疫症状,规律死亡。取其乳兔肌肉组织毒,制10％含毒量的甘油苗(病毒滴度=10~(-7.0)),该疫苗(7102批)在甘肃省成县红川公社、南康公社进行区域实验(该地区从1962年至今未发生过口蹄疫,也未注射过口蹄疫疫苗)。注射黄牛670余头,注苗6个半月～7个月及8个半月分别运回试验牛只,进行强毒攻击。所用强毒为牛源强毒A型44代,病毒滴度=10~(-7.0)     

牛口蹄疫Asia Ⅰ型灭活疫苗研究--疫苗效力、免疫持续期及安全性等检验

用选出的制苗用种毒AsiaⅠ L/96的不同代次BHK-21细胞传代毒试制疫苗3批,共13.1 L,在室内用健康牛进行了效力试验,保护率均达100%(5/5、5/5、5/5),对照牛全部发病(3/3、3/3、3/3);免疫持续期测定2批次,免疫后6个月的牛血清中和抗体效价为120-1120,8个月为18-160,经强毒攻击保护率达65%;保存期效力试验2批次,在2-8℃保存1 a,对该疫苗的效力无影响;最小免疫剂量为每头3 mL,注射免疫牛2322头,安全性良好,无不良反应.     

口蹄疫消毒试验——两种普通杀菌剂对口蹄疫病毒的消毒作用

(一)兰州面碱对O型口蹄疫病毒的消毒作用:根据前一试验报告,5％的兰州面碱在2℃作用2小时,对A型口蹄疫病毒无杀毒效力。为验证前一试验结果,我们重复了试验。用12％的兰州面碱溶液,与等量20％的O型口蹄疫牛舌皮毒(阿克苏牛源毒,于试验室用牛保存28代)悬液均匀混合(混合后,面碱即6％,pH9.6,病毒为10％),于2℃和26℃分别放置30～40、60、120分钟后,接种猪(体重15～20公斤,系A型鸡胚毒效力试验用过     

口蹄疫O-A-AsiaⅠ型三价灭活疫苗免疫效力和最小免疫剂量的研究

为确定口蹄疫O-A-AsiaⅠ型三价灭活疫苗的安全性和免疫效果,按OIE口蹄疫疫苗效检标准和我国口蹄疫灭活疫苗质量标准,对实验室条件下制备的4批疫苗进行了安全性试验、免疫效力试验、免疫持续期试验、疫苗保存期试验和最小免疫剂量试验。结果显示,4批疫苗均对靶动物和实验动物安全,无任何毒副反应;对O、A、AsiaⅠ型口蹄疫的平均免疫效力分别为4.73、6.84和8.10 PD50/头份;一次接种的有效免疫期达6个月;2~8℃下的疫苗保存期为12个月;适宜的免疫剂量为,6月龄以上牛每头3.0 mL,6月龄以下牛每头1.5 mL。该疫苗对接种动物安全,免疫效果良好,一次接种可同时预防O、A、AsiaⅠ型3个血清型的口蹄疫。     

ELISA抗体水平评价口蹄疫灭活疫苗免疫效果的可行性分析

为了探讨免疫抗体评价口蹄疫灭活疫苗效果的可行性,分别用5批次的口蹄疫O型-亚洲1型二价灭活疫苗(OS/99株+JSL/06株)、5批次的猪口蹄疫O型灭活疫苗(OZK/93株+OS/99株)免疫动物,在攻毒的同时采血分离血清,用液相阻断ELISA测定抗体效价,以分析抗体效价与免疫保护的关系。统计学分析表明,二价灭活疫苗的O型免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间呈正相关关系(P<0.01),相关系数为0.986;亚洲1型免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间呈正相关关系(P<0.05),相关系数为0.997,猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间不呈正相关关系(P>0.05)。结果表明,应用抗体水平评价二价灭活疫苗的免疫效果是完全可行的,但用其评价猪O型灭活疫苗的免疫效果不具有可行性。     

猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究——疫苗试制、检验、保存及区域试验

自1981年初开展猪瘟兔化弱毒牛肾细胞疫苗的研究以来,先后完成了一系列基础实验。在1983年试制第1批牛肾细胞苗的基础上,又重复试生产6批苗,经效检,均合乎标准。现将疫苗试制、检验、保存及区域试验结果报告如后。材料与方法(一)种毒 系农业部成都药械厂提供的480代冻干毒和F505代兔脾毒(湿毒),经本室复壮,选择定型热兔脾脏作为种毒,要求毒价不低于2×10~(-5)ID/ml。也可选用5万倍合格的细胞毒做种毒,脾毒和细胞毒以新鲜者为佳。     

猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的研究--效力、最小免疫量、免疫持续期和保存期试验

对中国农业科学院兰州兽医研究所研制的 8批猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗进行了效力试验 ,并对其中的 3批疫苗进行了最小免疫量、免疫持续期和保存期试验。结果表明 ,免疫猪对APP(Actinobacilluspleuropneumoniae) 1、3、7血清型强毒攻击的近期保护率分别为 91.6%、91.6%和 95 .8% ;免疫剂量为 1mL时 ,对APP 1、3、7血清型强毒攻击的保护率分别为 3 3 .3 %、3 3 .3 %和 5 0 .0 % ;免疫剂量为 2mL时 ,保护率分别为 88.9%、88.9%和 10 0 % ;免疫剂量为 3mL或 4mL时 ,保护率均为 10 0 % ;免疫后 12 0d和 180d时 ,攻毒保护率分别为 10 0 %、88.9%、10 0 %和 88.9%、77.8%、10 0 % ;疫苗经 4～ 8℃保存 180d和 3 60d后 ,攻毒保护率分别为 88.9%、10 0 %、10 0 %和 10 0 %、77.8%、88.9%。     

牦牛传染性鼻气管炎病毒85-Y株回归本动物试验

1985年12月我们从病牦牛的眼、鼻分泌物中分离到一株有致细胞病变能力的病毒,经血清学鉴定,初步认定为牛传染性鼻气管炎(IBR)病毒,并定名为85-Y毒株。为明确IBR病毒85-Y毒株对牦牛的致病性,进行了回归本动物试验。 材料与方法 (一)细胞 按常规方法制备犊牛肾(BK)继代细胞供种毒传代、毒价测定、病毒回收与鉴定。 (二)种毒 取85-Y毒株第6代冻干毒(-20℃下保存150天,毒价10~5TCID_(50)/ml)按常规方法在BK细胞上连续传4代作为种毒,经-20℃～37℃冻融3次后用于接种牦牛,同     

印楝种仁粗提物体外抗鸭瘟病毒活性的研究

采用索氏提取法及溶剂萃取法,用950mL/L乙醇提取印楝种仁并萃取,分别得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及水层。采用细胞病变(CPE)法及四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法研究三种萃取物对鸭瘟病毒(DPV)的抑制作用。结果显示,石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及水层对细胞的最大无毒浓度分别为0.007 8、0.003 9和0.125 0mg/mL;当其浓度为0.000 5、0.000 3及0.156 0mg/mL时,对DPV的抑制率各为13.23%、29.24%和11.72%。结果表明,三种萃取物对DPV均有不同程度的抑制作用,其中乙酸乙酯萃取物效果较好。     

表达狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒在犬体内的免疫效果

为研制一种新型有效的狂犬病重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,将酶切鉴定为正向连接的阳性重组子命名为p8AA-EGFP-rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得能够表达狂犬病病毒(RV)CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV/EGFP-rgp,经RT-PCR和Western-blot鉴定后对犬进行肌肉注射免疫,并测定相应试验指标,研究重组病毒对犬的免疫诱导情况.结果显示,重组病毒可以有效地刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;产生的针对RV的中和抗体水平[(0.95±0.21)U/mL]在14周时还保持相对国际最低保护标准(0.5U/mL)较高的水平;且产生的针对RV和PRV的中和抗体水平均达到了相应灭活疫苗和减毒活疫苗的水平,抗体效价均维持在14周以上.     

马立克氏病病毒gB基因的克隆及重组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒 (MDV) 2 .8kbgB基因 ,并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ酶切位点。然后用PstⅠ /NotⅠ酶切回收 gB片段 ,插入到转移载体 pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ /NotⅠ酶切位点处 ,构建了转移质粒pEFgpt12s gB。将该质粒与鸡痘病毒 (FPV)野毒 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过MXHAT选择培养基进行筛选 ,蚀斑纯化 ,经PCR扩增证实重组病毒中含有 gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别 ,病毒效价分别为 10 -5.43 TCID50 /mL和 10 -6TCID50 /mL ,表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性     

尼帕病毒病及其病原的研究进展

概述了尼帕病毒病在国外的流行状况、尼帕病毒(Nipah virus,NiV)的变异及我国的研究现状,着重阐述了近年来在其基础病毒学、诊断技术及防治方面的研究进展,主要包括病毒蛋白的功能及其相互作用、受体的发现、动物模型、荧光PCR及ELISA诊断技术、抑制NiV感染及治疗等方面的研究成果,为该病的深入研究提供了参考。     

H5N1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中,构建重组转移载体pSY(NA+LacZ),将其转染鸡胚成纤维细胞,经蓝白斑筛选,纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA,用其免疫SPF鸡,检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示,该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白,表达产物的分子质量约为55 ku;用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后,能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明,重组禽痘病毒rFPV-NA具有良好的免疫原性。     

应用PCR检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒

设计合成了 1对引物 ,建立用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒的PCR方法。结果表明 ,PCR对羊接触传染性脓疱性皮炎病毒细胞培养毒的检测与细胞培养CPE、电镜检测的结果相一致。经对扩增产物进行序列分析 ,与已报道NZ 2株的核苷酸序列同源性高达 97%。用此PCR方法扩增羊痘病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒 ,结果均为阴性。此方法用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒是可行的、特异的     

鸡马立克氏病病毒HC135分离株的致病性

从辽宁省某鸡场疑似马立克氏病发病鸡外周血淋巴细胞中分离到1株适应鸭胚成纤维细胞生长的马立克氏病病毒(MDV),经蚀斑克隆和细胞传代,成功培育了1株增殖性能稳定的MDV细胞毒株,命名为HC135株;将HC135株第4代细胞培养物分别人工感染非免疫和不同疫苗免疫的SPF鸡,分析其对鸡的致病力,分离毒株攻毒对照组鸡的发病率为100%(10/10),死亡率为30%(3/10);HVT疫苗及HVT/SB1双价疫苗对分离毒株的保护指数分别为22.2和40.0。结果表明,该毒株可以突破HVT疫苗和HVT/SB1双价疫苗的免疫保护,具有特超强毒株(vv+MDV)的特点;也证实了我国商品鸡群中存在vv+MDV毒株。同时比较了HC135株与14株参考毒株的Meq基因序列,发现其Meq基因的ORF内没有基因片段的插入或缺失,推导的氨基酸存在点突变,这种突变符合高毒力毒株的变异规律。     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒分离株SD1009株感染性克隆的构建与病毒拯救

为探究蛋鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的致病机理,从山东省某鸡场送检的蛋鸡病料中分离鉴定出1株ALV-J,命名为SD1009株,采用PCR方法分3段扩增出SD1009株的前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后顺次连接,获得1个含有完整ALV-J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009。全长测序及序列比对分析发现,近年来分离的ALV-J都存在缺失部分rTM和DR区的序列,缺失长度为205bp。通过外源基因嵌合的方式,将205bp嵌合进入,又获得了1个前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009A205,将pBW-SD1009和pBW-SD1009A205分别转染DF1细胞,通过间接免疫荧光试验,禽白血病抗原试剂盒检测,反转录酶试剂盒检验,表明拯救出了2株病毒,分别命名为rSD1009和rSD1009A205。本研究成功构建了蛋鸡ALV-J的感染性克隆,并在序列分析的基础上,又构建了第2株补全缺失序列的感染性克隆,结果表明缺失部分rTM和DR区的序列,对病毒的拯救以及病毒的复制动力学无显著影响。     

利用PCR检测鸭瘟病毒

参照文献 ,设计和合成了 1对引物。用这对引物 ,以标准毒株DPVF3 4的DNA为模板 ,经PCR扩增出 1个特异的DNA片段。经序列测定 ,该DNA片段由 42 0bp组成。与文献报道的序列比较 ,该片段为鸭瘟病毒UL6基因DNA的一部分 ,与美国毒株LakeAndes(LA)的同源性达 99%。用该PCR方法扩增小鹅瘟病毒、细小病毒和禽巴氏杆菌 ,结果为阴性。以该PCR方法检测 6份送检病料 ,5份为阳性 ,检出率与病毒的分离一致。另外 ,该方法检测DPVDNA的敏感性达到了 1pg水平     

LncRNA9606对猪流行性腹泻病毒复制的影响

长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度大于200 nt的非编码RNA分子,在调节多种生命活动中起着重要作用。本团队前期研究发现,宿主的lncRNA表达谱在猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染后发生显著变化。本研究选择其中一条差异表达的LncRNA TCONS_00009606(LncRNA9606),以研究它对PEDV复制的影响。为此,本研究首先检测LncRNA9606在PEDV感染后不同时间点的动态表达变化。结果,PEDV感染显著上调LncRNA9606的表达。随后对猪肠上皮细胞、派伊尔氏淋巴集合结以及外周血单个核细胞中LncRNA9606的表达丰度进行了分析,结果显示派伊尔氏淋巴集合结和外周血单个核细胞中的LncRNA9606含量显著高于小肠上皮细胞系细胞,并主要定位于细胞核中。在LLC-PK1细胞中过表达LncRNA9606后,PEDV复制水平显著降低。由此可见,LncRNA9606可在LLC-PK1细胞中抑制PEDV病毒的复制。