牛附红细胞体体外培养试验

用RPMI 164 0、M 199、D MEM 3种培养液作为基础培养基 ,再分别按体积分数加入 40 %的犊牛血清 ,采用普通恒温培养箱 (3 7℃ )进行牛附红细胞体体外培养。结果表明 ,牛附红细胞体在RPMI 164 0培养基中 ,每 12h更换 1次培养液 ,并补充适量正常红细胞 ,获得了高达 99%的感染率 ;连续传代培养可达 44代以上。     

小附红细胞体的分离鉴定及其对猪的人工感染试验

采用2对附红细胞体种特异性引物,对上海地区2个屠宰场采集的736份猪血液基因组DNA进行PCR检测,将小附红细胞体特异性引物扩增产物克隆到pMD18-T载体,进行序列测定和生物信息学分析。将小附红细胞体阳性血液分离物肌肉注射给5头切除脾的断奶广西巴马小型猪仔猪,感染后定期采血,进行显微镜检,并提取基因组DNA进行PCR检测。另设3头猪作为不感染对照组,进行相同的检测。结果显示,共有101份样品检测出附红细胞体阳性,阳性率为13.72%,其中54份为小附红细胞体单独感染,占7.34%。5头巴马小型猪在接种小附红细胞体后第13~16天起,至第34天试验结束,出现明显的临床症状;血液显微镜检和PCR检测均发现存在小附红细胞体感染;其序列测定显示,16SrRNA基因的部分序列与接种的小附红细胞体的相应序列完全一致。上述结果表明,本研究成功筛选出小附红细胞体阳性血液,并成功实现了小附红细胞体对巴马小型猪的人工感染试验。     

猪和兔附红细胞体的形态学及生殖方式观察

应用光镜和电镜对猪和兔附红细胞体的显微和超微结构进行了观察。结果表明,猪和兔附红细胞体在光镜和电镜下的形态结构、大小以及在红细胞上的附着方式等均无显著差别,其形态多为球形、卵圆形,直径0.2～2.5μm,在红细胞表面以一根或数根纤丝连接成串珠状或单个寄生。在透射电镜下,首次观察到附红细胞体边缘有一段20～30nm厚的光亮区域,并且在扫描和透射电镜下同时观察到附红细胞体的出芽生殖现象。由此推测,附红细胞体的发育方式为成熟的附红细胞体以出芽的方式产生1个未成熟形态的附红细胞体,随着未成熟形态附红细胞体的发育,逐渐从成熟附红细胞体体内脱离出来,最后以纤丝与成熟附红细胞体相连接;脱离出来的未成熟形态的附红细胞体黏附到同一红细胞或临近红细胞的膜上,最终发育成1个成熟的附红细胞体。     

猪附红细胞体a1基因的克隆及序列分析

为研究猪附红细胞体DnaK样蛋白HspA1编码基因a1的遗传变异规律,根据GenBank上登录的猪附红细胞体a1基因核苷酸序列(登录号AM265536)设计合成1对引物,从上海市3个屠宰场采集自然感染猪附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA作为模板,进行a1基因部分序列的PCR扩增、克隆、序列测定及生物信息学分析。结果显示,共获得了41条猪附红细胞体a1基因片段序列,序列长度均为1 657bp;同源性分析显示,它们与GenBank中登录的猪附红细胞体a1基因核苷酸序列的相似性在97.7%~99.9%之间,氨基酸序列的相似性在99.1%~99.8%之间。系统进化分析表明,多数上海市猪附红细胞体分离株的a1基因与GenBank中登录的德国54/96分离株a1基因序列在同一个聚簇上。     

猪附红细胞体PCR-ELISA检测方法的建立

根据猪附红细胞体OxaA膜蛋白基因设计了1对分别标记生物素和地高辛的引物,将PCR扩增产物固定至链霉亲和素包被的酶标板中进行酶联显色检测,并优化PCR扩增及ELISA检测步骤,建立了猪附红细胞体PCR-ELISA。结果显示,该方法较传统的PCR-ELISA节约近2h,最低能检出0.36pg的猪附红细胞体DNA,敏感性比常规PCR高10倍,且与猪链球菌、猪肺炎霉形体、大肠杆菌等无交叉反应。用该方法对64份猪血液中提取的DNA样品进行检测,结果阳性检出率为35.9%,明显高于常规PCR的28.1%。结果表明,建立的猪附红细胞体PCR-ELISA具有敏感、特异、安全和快速的特点。     

猪附红细胞体实验动物模型的建立

为建立一种合适的猪附红细胞体病动物模型,利用摘除脾和/或注射地塞米松的昆明小白鼠,以腹腔注射方式人工感染猪附红细胞体,通过血液涂片镜检、PCR检测、临床症状观察及病理剖检对感染情况进行了鉴定。结果显示,猪附红细胞体能够经腹腔注射感染昆明小白鼠,且感染鼠表现出与猪附红细胞体病相似的临床症状。结果表明,猪附红细胞体实验动物模型已成功建立,并证实啮齿类动物在附红细胞体的传播过程中发挥着重要作用。     

小附红细胞体mpg1基因的克隆及序列分析

根据猪附红细胞体3-磷酸甘油醛脱氢酶样蛋白1基因(msg1)序列设计引物,对上海地区分离的小附红细胞体阳性猪全血DNA进行PCR扩增,获得小附红细胞体3-磷酸甘油醛脱氢酶样蛋白1基因(mpg1)并进行测序和分析,研究其遗传变异特点。结果显示,共获得了11条小附红细胞体mpg1基因序列,序列长度均为1 011bp。同源性分析显示,所获得的11条小附红细胞体mpg1基因序列之间的相似性为96.8%~99.9%,预测氨基酸序列的相似性在97.9%~100%之间;与GenBank中公布的猪附红细胞体msg1基因核苷酸序列相似性在96.6%~98.2%之间,氨基酸序列的相似性为98.2%~99.1%。系统进化分析表明,msg1基因与mpg1基因共同构成每个聚簇。     

猪附红细胞体DnaJ基因的克隆及真核表达

为研究猪附红细胞体DnaJ基因的功能,根据GenBank中的猪附红细胞体全基因组序列（NC₀15153.1）,应用DNAStar、DNAMAN和ExPASy网络服务器筛选出1个候选蛋白基因DnaJ,设计合成1对特异性引物,经PCR技术扩增出DnaJ基因片段,克隆至pMD18-T载体上,并亚克隆到真核表达载体pVAX1上,构建了重组真核表达质粒pVAX-DnaJ,脂质体介导转染Vero细胞进行真核表达,RT-PCR和IFAT检测DnaJ基因在Vero细胞中的表达。结果表明,PCR扩增DnaJ基因的片段长度为876bp,编码292个氨基酸,与GenBank中的DnaJ基因同源性为99%;DnaJ基因在Vero细胞中获得瞬时表达。本试验为猪附红细胞体DnaJ基因的生物学特性及核酸疫苗的研究奠定了基础。     

猪附红细胞体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能定性与定量检测猪附红细胞体的方法,根据GenBank中猪附红细胞体的16SrRNA基因高度保守区设计了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了一种快速检测猪附红细胞体核酸载量的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法在107～101 copies/μL具有良好的线性关系(RSq=0.999)。能检测到模板的下限为30copies,灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。该检测方法与其他猪常见病病原体无交叉反应,具有良好的重复性。对临诊疑似猪附红细胞体感染猪血液进行了检测,其检出率比常规PCR方法高10%。表明该方法可用于临床上猪附红细胞体的检测及定量分析。     

猪附红细胞体PPA-ELISA检测方法的建立

用物理方法纯化猪附红细胞体抗原,用纯化抗原免疫兔制备超免疫血清,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗,建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA ELISA)检测方法。结果显示,用PPA ELISA方法检测猪血液中的附红细胞体,具有很高的敏感性和特异性,重复性良好,完全适用于猪附红细胞体病的实验室诊断。     

牦牛胎儿成纤维细胞的分离培养

采用30d胚龄左右的牦牛胚胎,用2种不同的消化液消化后,将所得的牦牛胎儿成纤维细胞(yak embryonic fibroblasts,YEF)培养于不同血清含量的RPMI1640培养液中,并接种于2种不同材质的培养瓶表面,对YEF的分离方法、培养所需胎牛血清(FBS)添加量和不同基质表面对YEF生长的影响进行了研究。结果表明,含150 mL/L FBS的RPMI1640培养基最适合YEF生长,可传代27次以上;经用RPMI1640和D-Hank’s液配制的2．5 g／L胰蛋白酶消化,所得的YEF的细胞活率差异不显著(P>0．05),其原代细胞在含100 mL／L胎牛血清的RPMI1640培养液中的贴壁率差异极显著(P<0．01);不同生长基质对YEF的形态没有显著影响。     

不同型牛血清对家兔原核胚序贯培养体外发育的影响

采用不同型血清分别添加到TCM199和mTCM199培养液、RPMI1640和mRPMI1640培养液中,对兔原核期受精卵进行了体外序贯培养,并对各组间不同时期发育率进行了分析比较。结果显示:体外培养至第72 h时,3个体外序贯培养体系间8-细胞胚率、桑椹胚率差异不显著(P>0.05),当体外培养至囊胚时,100 mL/L NBS TCM199(mTCM199)培养体系、100 mL/L NBS RPMI1640(mRPMI1640)培养体系的囊胚率均显著低于100 mL/L FBS RPMI1640(mRPMI1640)培养体系的囊胚率(三组的囊胚率依次是27.3%、35.9%、97.2%,P<0.01)。但前两组之间差异不显著。结果表明,不同型血清对兔早期胚胎体外正常发育具有很大影响,序贯培养中添加国产NBS的培养液的培养效果明显低于添加进口FBS的培养液的培养效果。     

羧化胶乳凝集试验检测边缘无形体血清抗体的研究

利用边缘无形体可溶性抗原 ,以化学交联的方式致敏羧化胶乳制成胶乳抗原 ,成功地建立了一种检测牛边缘无形体血清抗体的胶乳凝集试验 (LAT)诊断方法。用制备的胶乳抗原分别检测瑟氏泰勒虫、双芽巴贝虫、衣原体、附红细胞体阳性血清 ,结果均为阴性 ;与边缘无形体标准阳性血清、免疫牛血清、流行区血清样品均呈明显的凝集反应。研究结果表明 ,LAT方法具有操作简单、快速、敏感性高、特异性强、成本低廉等优点 ,是一种特别适合于基层现场检测边缘无形体血清抗体的新方法。     

四川省仔猪球虫病的流行病学调查

20 0 2年 7～ 9月抽样调查了四川省 12个市、县 16个猪场的球虫病流行情况。结果 ,仔猪球虫阳性场占 93.75 % (15 / 16 ) ,仔猪球虫总感染率为 2 5 .36 % (10 7/ 4 2 2 ) ;猪等孢球虫阳性场占87.5 0 % (14 / 16 ) ,猪等孢球虫总感染率为 18.72 % (79/ 4 2 2 ) ;在球虫阳性的仔猪粪样中初步鉴定出5种球虫 ,即粗糙艾美球虫、蒂氏艾美球虫、猪艾美球虫、豚艾美球虫及猪等孢球虫。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

猪链球菌抗体GDH重组蛋白PPA-ELISA检测方法的建立

以纯化的猪链球菌重组谷氨酸脱氢酶(GDH)蛋白作为包被抗原,酶标葡萄球菌A(PPA)蛋白为二抗,建立了检测猪链球菌抗体的间接PPA-ELISA诊断方法。经方阵滴定确定了抗原的最适包被浓度为12.5mg/L,血清样品的最佳稀释倍数为1∶80,PPA-ELISA阳性反应的临界值为D450nm≥0.378,交叉反应试验结果表明,该重组抗原与其他常见的6种猪病的阳性血清不发生交叉反应,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。经与武汉科前动物生物制品有限责任公司的商品化猪链球菌抗体检测试剂盒比较,二者的符合率为96.7%;对320份血清进行猪链球菌抗体检测,阳性检出率为73.1%。试验证明,所建立的PPA-ELISA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高,为大规模地进行猪链球菌病的流行病学调查和血清学诊断提供了有效的技术手段。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著(P<0.05),而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

牛地方流行性白血病液相蛋白芯片检测方法的建立

应用xMAP液相芯片技术原理,以原核表达的重组牛白血病病毒gp51蛋白为抗原,建立了检测牛白血病病毒抗体的LiquiChip液相蛋白芯片检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性与稳定性试验。结果表明,该方法对牛白血病病毒阳性血清检测阳性,对其他常见牛病毒阳性血清检测阴性,表明特异性好;液相蛋白芯片方法对牛白血病病毒抗体的检测敏感性可达119.7ng/μL,对多份牛白血病病毒阳性血清的检测结果显示该方法的检测敏感性与商品化ELISA试剂盒无显著差异;对3份牛白血病病毒阳性血清进行4次重复检测,批内、批间的变异系数均低于10%。所制备的偶联微球芯片保存3个月,其检测结果无显著差异。采用该方法对169份临床牛血清样品进行检测,检出阳性率达57.4%,该检测结果与瑞典进口ELISA试剂盒检测结果的符合率为94.67%。本方法为牛地方流行性白血病的进出境检疫、疫病监测和流行学调查研究提供了一种特异、敏感的新型快速检测技术。