TGF-β1对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA表达的影响

为研究外源性TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞表达CTGF mRNA的影响,用组织块法体外培养和纯化出奶牛乳腺上皮细胞,并应用免疫组织化学的方法鉴定细胞的纯度。然后用不同浓度的外源性TGF-β1(0,1,5,10ng/mL)作用乳腺上皮细胞,作用12,24,48,72h后分别提取细胞的总RNA,以β-actin作为内参基因,用实时荧光定量RT-PCR方法测定CTGF mRNA相对表达量的变化,并对CTGF的PCR产物进行测序分析。结果显示,TGF-β1处理组(1,5,10ng/mL)较对照组(0ng/mL)差异显著(P<0.05);处理组CTGF mRNA的相对表达量显著升高,并呈正量效关系:随着TGF-β1浓度的升高,CTGF mRNA的相对表达量基本呈逐渐升高的趋势。测序分析结果证明扩增产物为牛的CTGF基因序列,表明外源性TGF-β1可显著促进奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA的表达,进而在奶牛乳腺纤维化过程中发挥作用。     

热应激对猪原代睾丸支持细胞FasL与TGF-β基因表达的影响

为了探讨高温条件对猪睾丸支持细胞(stertoli cells)免疫豁免相关基因的影响,笔者分离培养猪原代sertoli细胞,利用差速贴壁法进行纯化,经sertoli细胞标记基因核酸与蛋白的检测鉴定,分离的原代sertoli细胞倍增时间为27.5 h。对原代sertoli细胞分别进行40℃与43℃热应激处理,并给予不同的热处理时间(0.25、1、6 h)与热应激恢复时间(0.5、1、2 h)处理,检测细胞内及上清中FasL与TGF-β基因的表达与蛋白的分泌差异。结果表明,热应激处理会使原代sertoli细胞FasL与TGF-β基因的表达量下降,但蛋白的分泌均上调,不同的热处理温度与时间并未有显著差异。热应激后复温处理对细胞内基因的表达有恢复作用,但是对细胞上清蛋白的分泌并没有显著影响,恢复时间在0.25 h～2 h内没有显著差异。     

钼对小鼠肾小管上皮细胞氧化损伤和骨架蛋白的影响

为研究钼(Mo)对小鼠肾小管上皮细胞的抗氧化功能及细胞骨架蛋白的影响,以小鼠原代肾小管上皮细胞为试验材料,通过向细胞培养基中添加0、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L不同浓度的Mo并培养24 h,用MTT法测定Mo对肾小管上皮细胞活力的影响,比色法测定氧化损伤程度,实时荧光定量PCR和Westernblot对细胞骨架蛋白Vimentin、α-actin、β-actin的m RNA和蛋白的表达进行测定。结果显示,与对照组(Mo剂量0组)相比,试验组(Mo剂量0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L组)小鼠细胞内的SOD和T-AOC均有下降(P0.01),而MDA升高(P0.01),LDH含量随Mo剂量的增加呈先下降后上升趋势(P0.01),CAT含量随Mo剂量的增加呈先上升后下降趋势(P0.01);同时,与对照组相比,试验组Vimentin、α-actin、β-actin的mRNA和蛋白的表达均随Mo剂量的增加而下降(P0.01或P0.05)。结果表明,高于0.4 mmol/L浓度的Mo作用24 h后,小鼠肾小管上皮细胞抗氧化能力受到抑制并加剧了细胞的氧化损伤,同时还会抑制Vimentin、α-actin、β-actin的mRNA和蛋白的表达。     

愈创蓝油烃促进皮肤创伤修复的研究

为了探究愈创蓝油烃促进创伤愈合的机制,选取40只SD大鼠制作皮肤创伤模型,随机分为蓝油烃治疗组和模型对照组。于造模后第3、7、14、21天各处死5只大鼠,用ImageJ软件测量创面面积,计算愈合率。用Masson染色观察伤口胶原沉积量,用qRT-PCR检测VEGF、TGF-β1、FGF-7、EGF、HGF、Smad2和Smad3的转录水平,用免疫组织化学方法检测创面微血管再生情况,用ELISA检测IL-1α、MPO、PGE-2和TNF-α的表达水平。结果显示,愈创蓝油烃组的创伤愈合率高于模型对照组的。在用药后第3天,用qRT-PCR检测相关生长因子,结果显示,愈创蓝油烃组EGF的表达量显著低于对照组的,TGF-β1的表达量与对照组的无明显差异;第7天,Smad2的表达量与对照组的无明显差异;其余各时间点,愈创蓝油烃组VEGF、HGF、FGF-7、Smad3的转录水平均高于对照组的。由Masson染色结果可见在创伤愈合的整个过程中,蓝油烃处理组大鼠的胶原沉积率高于对照组的。由免疫组织化学检测结果可见在第3和7天时,蓝油烃处理组的创面微血管密度高于对照组的,第14天时则低于对照组的。ELISA结果显示第3和7天时,愈创蓝油烃组IL-1α含量低于对照组的,而第14天时略高于对照组的;于第3、7天时,愈创蓝油烃组MPO含量较对照组的略有下降,但在第14天时略高于对照组的;各时间点治疗组PGE-2水平均低于对照组的;治疗组大鼠TNF-α水平在第3天时略高于对照组的,在第7和14天时愈创蓝油烃组低于对照组的。结论:愈创蓝油烃可促进大鼠皮肤创伤愈合。其作用机制可能是通过调控伤口胶原蛋白的沉积、抑制IL-1α和MPO等炎症因子的表达和上调TGF-β1与FGF-7等生长因子的表达等促进伤口愈合。     

雌性骆驼生殖组织β-防御素-1基因的克隆及其组织表达量的检测

从雌性骆驼输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA,根据已发表的骆驼β-防御素-1基因的cDNA序列设计合成引物,采用RT-PCR扩增出了骆驼β-防御素-1基因;将扩增产物克隆于pBlueselectT载体后进行了序列分析。以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参,对扩增的β-防御素-1基因进行琼脂糖凝胶电泳后,应用凝胶成像分析系统,推断出了不同组织中β-防御素-1基因的表达量。结果,从雌性骆驼生殖各组织上皮均获得了203 bp的β-防御素-1基因的扩增片段,且β-防御素-1基因在雌性骆驼生殖道各组织内的表达量不同。结果表明,β-防御素-1在雌性骆驼生殖组织的先天免疫中起重要作用。     

大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1和NF-κB及TLR4表达的影响

为研究大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1表达的影响以及对其信号转导通路Toll样受体4(TLR4)的表达和核转录因子κB(NF-κB)活化的影响,采用热灭活的不同浓度大肠杆菌菌液(0、1×105、1×106、1×108 CFU/mL)作用于奶牛乳腺成纤维细胞,分别于不同时间点(作用后第6、12、24、48小时)运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TGF-β1和TLR4mRNA的表达,运用Western-blot检测TGF-β1、TLR4和p-NF-κB-p65蛋白的相对表达量。结果显示,大肠杆菌作用BMFB后,TGF-β1mRNA和蛋白的表达量显著的升高,并且TGF-β1mRNA的表达呈明显的时效及量效关系,于第24小时达到高峰后降低(P0.05);TGF-β1蛋白的表达量呈量效性(P0.05)。TLR4mRNA和蛋白表达水平显著升高,并且TLR4mRNA和蛋白的表达呈时效性和量效性,分别于作用后第24和12小时达到最高后逐渐下降(P0.05)。p-NF-κB-p65的表达与大肠杆菌作用浓度呈正量效关系,表达量随作用时间延长先升高后逐渐降低(P0.05)。上述研究结果表明,热灭活的大肠杆菌能够促进BMFB的TLR4表达,并激活BMFB p-NF-κB-p65蛋白的表达,从而促进TGF-β1的表达。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。     

雌激素受体在间情期绵羊输卵管上皮细胞中的表达

为探讨膜性雌激素受体GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1)及雌激素核受体ERα、ERβ在绵羊输卵管上皮细胞中的表达和定位,探讨三种受体在间情期绵羊输卵管中的表达规律,通过RT-qPCR方法和免疫印迹方法分别检测了三种受体基因mRNA水平和蛋白水平的表达差异;运用免疫组化法对输卵管组织中三种受体基因进行定位并对结果进行光密度值分析。结果,输卵管上皮细胞中GPER相对表达量高于ERα、ERβ(P0.01),ERα的相对表达量高于ERβ(P0.05)。免疫组化结果显示,GPER广泛分布于绵羊输卵管上皮细胞中,主要定位于细胞膜及细胞质。而ERα及ERβ主要分布于绵羊输卵管上皮细胞的细胞核。阳性细胞光密度分析结果与荧光定量RT-qPCR的分析结果相一致。上述结果表明,间情期绵羊输卵管上皮细胞中同时存在GPER、ERα、ERβ三种雌激素受体表达,且GPER的平均光密度、mRNA相对表达量最高,ERβ的平均光密度、mRNA相对表达量最低。     

犬Mnx1基因过表达载体的构建及其对脂肪间充质干细胞向胰岛β细胞分化的影响

本研究旨在构建犬Mnx1基因腺病毒过表达载体,并探究Mnx1基因过表达对犬脂肪间充质干细胞向胰岛β细胞方向分化的影响。本试验构建了腺病毒重组表达载体pAD-Mnx1,经293A细胞包装扩增后产生具有感染性的重组腺病毒,将其按感染复数(MOI)100感染犬ADSCs后,分别在第3、6、9、12和15天观察绿色荧光蛋白的表达情况、细胞形态变化和胰岛β细胞发育相关基因的表达情况。结果显示,ADSCs在感染后24 h出现绿色荧光,形态无显著变化;Mnx1基因表达可激发胰十二指肠同源盒1(Pdx1)基因、神经元素3(Ngn3)基因、肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(Mafa)基因、NK2同源盒2(Nkx2.2)基因、NK6同源盒1(Nkx6.1)基因、神经分化因子1(Neurod1)基因、成对合基因4(Pax4)和GATA结合蛋白4(Gata4)基因等内源性基因的表达。结果证实,腺病毒介导的过表达载体pAD-Mnx1可在犬ADSCs超表达Mnx1基因,从而诱导犬ADSCs向胰岛前体细胞分化,具有进一步诱导犬ADSCs形成胰岛β细胞的可能。     

17β-雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞Ghrelin表达量的影响

为了研究17β-雌二醇对Ghrelin表达量的影响,根据绵羊Ghrelin基因mRNA的保守序列设计特异性引物,通过体外培养绵羊输卵管上皮细胞,提取经17β-雌二醇处理的绵羊输卵管上皮细胞总RNA,并反转录成cDNA,以β-actin基因为内参,采用SYBR GreenⅠ染料法进行实时荧光定量PCR检测。结果显示,绵羊输卵管上皮细胞经17β-雌二醇处理后,Ghrelin基因的表达量有显著性增加,在处理后第6小时表达量达到最高。结论,17β-雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞表达Ghrelin有显著的促进作用,这为后续试验研究打下了良好基础。     

小反刍兽疫病毒H基因或F基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

为构建能够表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H基因或F基因的重组山羊痘病毒(GPV)并以此为活载体疫苗,在通用转移质粒pTKfpgigp的多克隆位点中插入PPRV的H基因或F基因,构建重组转移质粒pTKfpgigp-PPRV H和pTKfpgigp-PPRV F,并用Lipofectamine 2000转染已感染GPV的原代绵羊睾丸细胞,经同源重组产生重组GPV(rGPV)。用GFP和gpt选择标记筛选纯化rGPV,通过RT-PCR和免疫荧光技术检测rGPV在原代绵羊睾丸细胞中外源基因的表达情况。将获得的rGPV皮内接种山羊,检测抗山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒的特异性抗体的变化情况。结果显示,获得了含有PPRV H基因或F基因的病毒株rGPV-PPRV H和rGPV-PPRV F;在原代绵羊睾丸细胞中rGPV所含的外源基因进行了正常转录和翻译,表达产物能与PPRV抗血清产生特异性反应,动物免疫试验表明,2株rGPV能诱导产生高水平的抗山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒的特异性抗体。上述研究结果为PPRV重组标记疫苗的研制提供了参考。     

BALB/c小鼠SLIT2和ROBO4基因组织特异性表达与分布的研究

SLIT2/RO BO4信号通路在炎症血管反应、白细胞渗出和血管再生等方面发挥重要作用。为深入了解SLIT2/ROBO4信号转导途径在炎症性疾病发生发展过程中的作用机制,本研究采用RT-q PCR和免疫组织化学的方法对SLIT2和ROBO4基因在BALB/c小鼠组织特异性的表达和分布进行了研究。结果表明:SLIT2在肾脏、心脏、肺脏和大脑中表达相对较高,在肾脏表达量最高;ROBO4在心脏、肝脏、肺脏和肾脏中表达相对较高,在心脏中表达量最高。免疫组织化学检测表明,SLIT2和ROBO4在心肌细胞、肝细胞、脾脏的内皮细胞、肺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞和大脑皮质神经元中表现出相似的阳性定位。研究结果为深入探讨SLIT2/ROBO4信号通路在炎症性疾病发生发展和调控中的分子作用机制提供了基础数据,也为发展基于该通路的器官特异性炎症治疗策略提供了科学依据。     

旋毛虫P49和P53ES抗原基因的真核表达

将构建的重组质粒pEGFP-N1-P49和pEGFP-N1-P53同时进行双酶切,回收P53基因片段和pEGFP-N1-P49载体,再将P53基因片段重组到pEGFP-N1-P49中,构建旋毛虫ES抗原P53和P49融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-P49-P53,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7。于转染后第24小时在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的转基因细胞;Western-blot分析证实目的基因的表达产物具有抗原性。结果表明,成功构建了含有旋毛虫ES抗原P53和P49融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-P49-P53,并在COS-7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。     

蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA相对表达水平的实时荧光定量PCR检测

为了检测培养的蒙古绵羊输卵管上皮细胞内sBD-1 mRNA表达水平,运用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术进行了相对定量测定.首先,建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外试验模型,提取细胞总RNA,根据GenBank中羊β-防御素基因序列,设计合成引物,进行实时荧光定量PCR.以β-Actin基因为内参基因,对sBD-1 mRNA进行均一化处理,利用荧光阈值(C2值)计算sBD+1 mRNA的相对表达量.经测序分析,扩增产物为β-防御素.结果显示,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素mRNA表达水平的相对含量.     

鸡细胞因子实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据鸡IL-6I、L-1β、IFN-γ、TGF-β4 mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经鞭毛蛋白刺激的鸡巨噬细胞HD11总RNA,并反转录成cDNA,建立了实时荧光定量PCR方法。结果显示,融解曲线均呈单一峰;同一份cDNA经过3个相同反应体系的实时荧光定量PCR扩增后,其扩增曲线基本重合。HD11细胞经鞭毛蛋白刺激后,前炎性细胞因子IL-6和IL-1β的相对表达量分别为14.90和29.09,与对照组相比显著升高(P0.05);而IFN-γ与抗炎性细胞因子TGF-β4的相对表达量无显著变化(P0.05)。应用该方法检测了3份沙门菌感染鸡血液样品异嗜白细胞中这4种细胞因子的表达水平,前炎性细胞因子IL-6、IL-1β的相对表达量分别为6.19和2.39,与对照组相比显著升高(P0.05);TGF-β4的相对表达量无明显变化(P0.05)。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好,为定量检测鸡细胞因子的一种快速、准确的方法。     

禽流感病毒H7亚型血凝素基因的原核表达及鉴定

参考已发表的禽流感病毒 (AIV)H7亚型血凝素 (HA)基因序列设计引物 ,经RT PCR扩增了AIV H7亚型的HA1基因片段 ,再将该片段定向插入到原核表达载体 pGEX 4T 2中 ,转化大肠埃希氏菌。重组表达载体经酶切和测序鉴定后 ,用IPTG诱导表达。用Western blotting和ELISA试验鉴定表达产物的抗原性。结果表明 ,融合表达蛋白能与AIVH7N1、H7N2、H7N7和H1N1亚型标准抗血清反应 ,而与H5N1、H9N 2等其他 13个亚型的抗血清无交叉反应。     

胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化的影响

对分离自20日龄雄性SD大鼠附睾和肾周白色脂肪组织的前体脂肪细胞进行原代培养,并采用MTT比色法、油红O染色提取法分析了100~400 nmol/L胰岛素对其增殖、分化的影响,同时利用半定量RT-PCR分析了该浓度胰岛素对分化标志基因———脂肪酸合酶(FAS)、乙酰CoA羧化酶α(ACC1)基因mRNA表达的影响。结果显示,胰岛素能有效地促进前体脂肪细胞的增殖和分化(P<0.05),在400 nmol/L以下具有剂量依赖性;胰岛素处理72 h能显著提高脂肪细胞FAS和ACC1基因mRNA的表达水平(P<0.05)。证实胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化有明显促进作用。     

广西黄鸡β-防御素Gal-4基因的克隆和体内诱导表达

采用RT-PCR方法从广西黄鸡骨髓中扩增了β-防御素Gal-4基因的cDNA片段。序列分析结果表明,获得的广西黄鸡Gal-4基因大小为321 bp,推导的Gal-4由63个氨基酸组成,其中N端20个氨基酸为信号肽,C端38个氨基酸组成Gal-4的成熟肽。另外,分析了Gal-4基因在正常广西黄鸡(对照组)和H9N2禽流感病毒感染的广西黄鸡(感染组)的肺、肝、腔上囊、十二指肠、肾、气管组织中的表达情况。分析结果表明,在检测的6个组织中,肺、十二指肠、肾组织Gal-4基因的表达在感染组和对照组之间没有明显的差别,而在肝、气管和腔上囊组织中的表达有明显差异,感染组比对照组的Gal-4阳性样品数多。在肝组织中,对照组的30个样品检测到26个阳性样品,而感染组的30个样品全都是阳性；在气管组织中,对照组30个样品检测到19个阳性样品,而感染组的30个样品检测到24个阳性样品；在腔上囊组织中,Gal-4基因的诱导表达情况非常明显,对照组30个样品中仅有9个阳性,而感染组的30个样品中有21个阳性。     

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染对BMEC炎性因子mRNA表达的影响

为了探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)在不同时间点对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)相关炎性因子转录水平的调节作用。本试验通过体外培养BMECs并对其进行免疫细胞化学方法鉴定。选取纯化后的原代BMECs,分别加入活菌比(MOI)为100∶1的最佳浓度的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌对细胞进行感染,分别在感染后第0、3、6、9、12小时采样,采用qRT-PCR法检测IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达情况。结果显示,在添加1×102CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第6小时IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。在添加1×101CFU/m L大肠杆菌作用至第6小时,IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L大肠杆菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L大肠杆菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。本试验结果表明,使用最佳浓度金黄色葡萄球菌或大肠杆菌作用于BMECs时,在最佳感染时间点可显著上调IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达量。IL1R1、IL-1β及TNF-αmRNA表达量在临床上可作为创伤后炎症反应的敏感指标,能评价炎症反应的严重程度,对乳腺炎的病程诊断具有重要意义。本试验结果为进一步研究细菌感染引起乳腺炎的致病机理提供了理论依据。     

柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体TNF-α基因表达动态的关系

根据GenBank上鸡β-actin、TNF-α的基因序列设计引物,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆获得了β-actin和TNF-α基因,采用β-actin为内参的半定量方法检测TNF-αmRNA在鸡柔嫩艾美球虫免疫前后不同时间的表达情况,以探讨TNF-α基因的表达动态与柔嫩艾美球虫免疫的关系.结果显示,TNF-α基因在两次免疫期间的表达量整体上呈现双峰模式,首免后第9 d达到一个高峰,二免后第7d达到另一个高峰.结果表明,TNF-α在抗球虫感染中有一定的作用.