GFP标记的重组新城疫病毒HN基因乳酸菌表达载体的构建及原核表达

为构建具有示踪特性的新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸菌穿梭表达载体,采用PCR方法扩增NDV HN基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因,将两基因克隆至乳酸菌表达载体pW425et中,转化入表达宿主菌BL21(DE3)后利用IPTG诱导表达。用荧光显微镜检查重组菌的绿色荧光效应,采用SDS-PAGE和Western-blotting检测其在大肠杆菌中的表达情况。结果显示,NDV HN和GFP基因与表达载体pW425et正确重组。荧光显微镜下可见阳性重组菌落的绿色荧光,且该重组菌传代30代次以上,荧光效应依然稳定。SDS-PAGE显示表达出约63ku的条带,与已知表达的HN蛋白大小相符。Western-blotting进一步证实该蛋白能被NDV阳性血清所识别,具有反应原性。构建了GFP标记的重组NDV HN基因乳酸菌穿梭表达载体且能在大肠杆菌中表达。     

鸡PrP基因真核表达载体的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达

为构建鸡PrP基因的真核表达载体,并通过毕赤酵母表达系统获得鸡朊蛋白(ChPrP),根据毕赤酵母GS115的密码子偏好性、G+C含量等特点对目的基因PrP(25~248)进行密码子优化与基因合成,同时以特异性引物扩增获得天然未经密码子优化的目的片段,之后将两种目的片段分别连接于pPIC9K表达载体并转化至毕赤酵母GS115中,经PCR,选择培养基MM、MD方法鉴定表型后以甲醇进行诱导获得目的蛋白,最后以SDS-PAGE检测蛋白表达。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,成功构建了真核表达重组载体pPIC9K-PrP(25~248),并在毕赤酵母GS115中获得鸡朊蛋白,其与未经密码子优化的目的蛋白相比,具有更高的表达量。本研究通过毕赤酵母表达系统成功获得了鸡朊蛋白,为后续研究奠定了基础,也通过密码子优化前后蛋白表达量比对,再一次证实毕赤酵母具有较高的密码子偏好性。     

堆形艾美球虫广东株3-1E基因在毕赤酵母中的表达

以重组质粒pGEM-3-1E为模板,扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株3-1E基因(长度为529 bp),将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中,构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母,甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测,表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。     

鸡α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性的测定

将克隆的鸡α干扰素(ChIFNα)基因亚克隆至酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组质粒pPIC-ChIFNα,线性化后电转化整合到毕赤酵母菌株X-33基因组中,得到阳性菌株。经1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE检测结果表明鸡α干扰素在酵母中获得了分泌型表达,表达产物分子质量约为18 ku。细胞病变抑制法检测其效价为1×10~(7.69)U/mL;在鸡胚中能有效抑制禽流感病毒H9N2的增殖。针对Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株强毒的动物攻毒保护试验结果显示,表达的蛋白具有较好的抗病毒活性。     

新城疫病毒HN基因与T4噬菌体SOC基因在大肠埃希氏菌中的融合表达

用RT PCR方法扩增了新城疫病毒 (NDV)的完整HN基因序列 ;设计了 1对带有EcoRⅠ限制位点的引物 ,用PCR扩增出了HN基因片段。将该片段克隆至 pSOC质粒SOC基因 3′端 ,成功构建了重组质粒pSOC HN。用该重组质粒转化E .coliBL 2 1(DE3)感受态细胞 ,以终浓度 1mmol/mL的IPTG诱导表达。在SDS PAGE凝胶上可检测到分子质量约 6 7ku的特异条带 ,蛋白质印迹法证实 ,表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫(Orientobilharzia turkestanicum)成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因(TPI),鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接,构建重组表达质粒pPIC9k-TPI,并将其电击转化到毕赤酵母GS115中,重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白,经SDS-PAGE、western-blotting检测,并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示,成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43 ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

微小牛蜱Bm91基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

从我国半饱血微小牛蜱雌性成蜱肠道和唾液腺中提取总RNA;参照GenBank中已发表的微小牛蜱Bin91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物.采用RT-PCR技术扩增Bm91基因,测序正确后将其亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的EcoR I酶切位点,构建重组表达载体pPIC9K-Bm91.再次测序正确后将其用Sac Ⅰ内切酶线性化,电转化毕赤酵母GS115并经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,Bm91基因获得了成功表达,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的83 ku的重组Bm91蛋白.     

重组鹅源新城疫病毒HN基因乳酸菌的构建

构建了重组鹅源新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸杆菌后,将HN基因亚克隆至可在乳酸杆菌和大肠杆菌中穿梭表达的载体pSIP409中。此后,将构建的阳性重组体pSIP409-HN采用电转化方法转化至植物乳酸杆菌感受态细胞中。利用SDS-PAGE和Western-blot检测HN蛋白的表达情况。为明确HN蛋白的表达位置,利用流式细胞术检测了重组菌细胞是否有HN蛋白的表达。结果显示,克隆了NDV HN基因,构建了阳性重组质粒pSIP409-HN;鉴定结果表明,阳性重组质粒pSIP409-HN被成功电转化至乳酸杆菌感受态细胞中。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,构建的重组菌可以表达与HN蛋白已知大小相符的条带(66ku),且该蛋白能与NDV阳性抗体反应,具有反应原性。流式细胞术检测结果表明,HN蛋白被表达于菌体细胞表面,可作为黏膜疫苗的候选抗原。     

胸膜肺炎放线杆菌apx I A基因在不同宿主系统中的表达及密码子偏好性分析

用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型参考株APP259的基因组DNA中,扩增了约954 bp的apx I A基因片段,分别构建了大肠杆菌表达栽体pGEX-4T-1/apx I A和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apx I A.对目的基因密码子偏好性进行了分析,发现其中有4个大肠杆菌稀有密码子,占1.2%;有49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%.利用所构建的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apx I A和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apx I A分别进行表达.结果显示,目的基因在大肠杆菌中能以包涵体形式进行高效表达,其融合蛋白占菌体总蛋白的32%;在毕赤酵母中则以较低水平分泌表达至培养基的上清液中,40倍浓缩后方能检测到少量目的蛋白.证实,目的基因序列中的密码子偏好性影响其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达.     

惠阳胡须鸡Ⅱ型干扰素基因在毕赤酵母中的表达及其产物活性分析

为了确定惠阳胡须鸡IFN-γ基因(chIFN-γ2)在毕赤酵母中表达的重组蛋白的抗病毒活性和蛋白的二级结构,将pGEM-T-chIFN-γ2重组质粒中的chIFN-γ2基因克隆到表达质粒pPICZαB上,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后的序列同源性分析,证明目的基因没有发生缺失、突变,并且插入方向正确。将重组质粒电转化到毕赤酵母感受态细胞GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达。重组IFN-γ的分子质量约为33 ku,表达量达0.604 mg/mL,在鸡胚成纤维细胞(CEF)上抑制VSV的抗病毒活性为3.2×104U/mg。圆二色性分析表明,IFN-γ酵母重组蛋白属于典型的α螺旋蛋白,二级结构含量为:α螺旋55.1%,β折叠8.3%,转角13.9%,无规卷曲22.8%。采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-γ,并首次证明鸡IFN-γ重组蛋白属于典型的α型蛋白。     

俄语“人体成语”的认知语义分析——以带глаз,нос的成语为例

“人体成语”是指含有表示人体各部位名称及关于人的知、情、意、行等语素的成语。俄语成语中与人体有关的成语所占比例较高，其中使用频率较高的是带глаз,нос的成语。从认知角度对俄语“人体成语”的构成成素进行分析，区分人体成语的概念意义和范畴意义，用隐喻模式和换喻模式对“人体成语”进行认知语义分析很有必要。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

布洛芬-β-环糊精包合物的制备及其药剂学性质的研究

采用共沉淀法制备了布洛芬(ibuprofen,BF)-β-环糊精(β-cyclodextrin,β-CD)包合物.经差示扫描量热法、红外光谱法、核磁共振法鉴定,BF与β-CD确已形成包合物;溶解度试验证明,β-CD对BF具有显著的增溶效果;3批产品的平均含药量为11.98%±0.35%,平均产率为79.83%±0.43%;溶出度试验结果显示,45 min内包合物中药物的溶出度比原药BF的溶出度显著加快(P＜0.01).     

俄罗斯科学院东方学研究所

俄罗斯科学院东方学研究所是俄罗斯最大的东方学研究机构。东方学研究所及其下属的圣彼得堡分所,是俄罗斯研究中国问题时间最长的机构之一。研究所机构设置齐全,既是科学研究机构,也是博物馆和图书馆,在国际学术界占有重要地位。历史渊源东方学所至今已有180年历史。1818年,东方学所的前身——俄罗斯皇家科学院亚洲博物馆在圣彼得堡成立。首任馆长为克里斯汀·弗伦院士。成立之初,亚洲博物馆主要收藏各种来自东方的文物和文献,当时博物馆最重要的藏品是彼得大帝的遗书。到19世纪初,俄罗斯探险家在中亚和中国西北地区掠夺的大量珍贵文献和文…     

"中国学派"国际关系理论的本体论认知

"'中国学派'国际关系理论框架到底是什么"已成为学界关注的一个重要问题.本文立足中国哲学的文化根基,同时尊重马克思主义的思想传统,将两者融合成新的本体论认识,以"陆王"心学的认识论作为过渡进一步论述儒家思想在国际关系方面的方法论原则,提出"中国学派"国际关系理论的基本认知,尝试在哲学意义上回答"‘中国学派'国际关系理论框架到底是什么"这一问题.     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

印度软件企业生产国际化的组织实施

印度软件企业出口生产的国际分工特征表现为:区域分工以现场服务和离岸开发为主,技术分工以编程、测试和维护为主。通过设立软件技术园区作为出口生产基地以发挥企业区域集群优势和利用跨国公司技术创新国际化趋势进行跨国生产和研发来组织实施的。     

猪囊尾蚴病免疫原的分子生物学研究进展

猪带绦虫有成虫、虫卵、六钩蚴、囊尾蚴不同形式的发育阶段和寄生状态 ,不同的虫体形式以独特的组织结构和生命活动规律满足其寄生在相应宿主体内的需要[1 ,2 ] 。研究发现 ,六钩蚴与囊尾蚴在虫体组成成分、生化指标以及代谢 (分泌 )产物等方面都有差异。SDS PAGE和免疫印迹研究表明 ,六钩蚴的抗原成分非常复杂 ,不仅有共同抗原、阶段发育特异性抗原 ,而且在入侵宿主定植在肌肉组织后 ,表面抗原随虫体的发育而发生阶段性的改变 ,并且抗原变异的发生往往比免疫应答更为迅速 ,从而使宿主产生的抗体失去保护性。在生化指标及代谢关键酶方面 …     

对苏获波兰战俘问题的系统考察

本文依据档案资料,对苏获波兰战俘问题的各个环节进行了较为系统的考察,一方面比较清楚地交代了苏联对波兰战俘采取的一系列政策措施,如部分遣返、分类关押、劳动使用、思想教育、侦探肃反和秘密处决等,另一方面也比较清楚地交代了被关押战俘的生活状况、思想情绪、人数变化和不幸遭遇以及所有波兰战俘的流向和归宿.对于"卡廷惨案"被公布于世后苏联围绕该案所作的各种自欺欺人的文章,本文也进行了较为详细的披露和叙述.     

海豹静脉给药位置及操作的探讨

海豹皮下脂肪很厚,给药途径大多采用投喂和肌肉注射方式,对病海豹通过静脉给药在国内尚未见报道。1997年笔者对2例病海豹在后肢掌部进行了静脉给药,效果满意。1　操作方法1.1　保定　对先后患病的2只海豹装入比海豹个体稍大、用铁条做的笼内,用木板、木棍等分别以海豹不同部位插进使其不能调头和退出,然后将海豹后肢的笼门适当抽开,让海豹双后肢置于笼外。1.2　静脉位置　选取后肢掌部外侧的皮下静脉。1.3　给药方法　找出静脉血管并使其显露,用4号针头静脉穿刺,待有血液回流输液管后,即可静脉推注给药。2　结果第1例病海豹经诊断为肺炎和出…