马流感病毒NP基因的原核表达及其抗原性分析

采用RT-PCR方法从马流感病毒中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)中扩增了NP基因片段,将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,测序验证后转化入表达宿主菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌表达出约64ku、以可溶性形式存在的重组融合蛋白,且在0.2mmol/L IPTG条件下诱导6h表达效果最好。表达产物经镍柱纯化后得到纯度较高的目的蛋白。经Western-blot和间接ELISA分析,纯化的蛋白只与抗马流感病毒阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性和特异性。     

非洲猪瘟病毒P54基因原核表达载体的构建与表达

根据GenBank中非洲猪瘟病毒(ASFV)P54基因序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法从ASFV DNA中分别扩增出了P54基因片段和经过改造的跨膜信号肽缺失的P54基因,将其克隆到表达载体pET28b中,构建了重组质粒pET-P54和pET-P54q,测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE,Western-blotting检测.结果显示,经过改造的信号肽缺失的重组菌pET-P54q可表达出分子质量约24.5 ku的重组融合蛋白,表达的蛋白以可溶形式存在于菌体中,经镍柱亲和层析纯化可获得纯度较高的目的蛋白.纯化的蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,证实,表达的蛋白具有较好的反应原性.     

赤羽病病毒核衣壳蛋白基因的表达纯化及活性鉴定

为获得赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳蛋白重组抗原,经RT-PCR扩增了OBE-1株的S节段,将其插入到pMD 18-T载体,然后用带有酶切位点的引物从该重组载体亚克隆出表达核衣壳蛋白的N基因,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样处理的表达载体pET-28a( )进行连接,转化感受态细胞BL21(DE3)。将筛选出的阳性克隆进行测序、IPTG诱导表达和融合蛋白纯化及活性鉴定。结果表明,N基因含有1个全长702 bp的ORF,编码233个氨基酸,通过SDS-PAGE和Western-blotting分析,证实重组菌株可高效表达有免疫活性的分子质量约27 ku的可溶性融合蛋白,用薄层扫描仪分析,其最高表达量占可溶性菌体蛋白总量的58.5%。工程菌经超声波裂解高速离心后,上清液在ProBondTMPurification System(含Ni2 )天然状态下纯化,可获得高纯度的融合蛋白。     

口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析

利用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒(FMDV)编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因,经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1( )中,重组质粒pcDNA3.1( )-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞,用纯化的目的蛋白进行Western-blotting鉴定,并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示,获得分子质量约55 ku的单一3D基因表达产物,其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术,证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。     

比格犬β-防御素cBD1基因的原核表达与鉴定

为获得比格犬β-防御素cBD1基因的表达产物,根据GenBank中登录的犬β-防御素基因cBD1(canis familiarisβ-defensin-like peptide 1)的序列设计引物,提取比格犬睾丸组织总RNA,利用PCR扩增cBD1基因,然后将其克隆至pET-32a(+)载体,构建原核表达质粒pET-32a-cBD1,通过PCR、酶切鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导和His-Ni-resin纯化目的蛋白。经SDS-PAGE检测,获得了约28ku的表达产物,与预期大小的β-防御素cBD1的分子质量相一致。Westernblot分析表明,表达产物与抗His标签鼠单克隆抗体发生反应,显示重组蛋白获得了表达。结果表明,成功表达的cBD1为新型抗菌制剂的研制奠定了试验基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344 sseK2基因的克隆表达及生物信息学分析

为研究鼠伤寒沙门菌SL1344株SseK2蛋白的生物学特性,通过PCR扩增sseK2基因,构建原核表达质粒pET-32a-sseK2,经大肠杆菌BL21(DE3)表达、纯化后经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,对sseK2基因编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,鼠伤寒沙门菌SseK2蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,纯化获得较高纯度的蛋白。生物信息学分析显示,SseK2蛋白为可溶性蛋白,由348个氨基酸组成,分子质量约39.57 ku。该蛋白不含信号肽、无跨膜区,为膜外蛋白,包含4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、56个磷酸化位点、15个B细胞线性结合位点和8个T细胞结合位点以及10个二硫键。其蛋白二级结构中以α-螺旋(Hh)占33.05%,无规则卷曲(Cc)占27.30%为主。成功构建了原核表达载体,并对其进行生物信息学分析,为进一步研究sseK2基因的生物学功能及在沙门菌致病机制中的作用奠定了良好基础。     

肉鸡线粒体型硫氧还蛋白的原核表达及抗氧化特性评价

为了研究肉鸡线粒体型硫氧还蛋白(GgTrx2)的功能,提取肉鸡肝总RNA,经RT-PCR扩增去除信号肽序列的GgTrx2基因,构建原核表达载体pET-28a(+)-GgTrx2,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;以Ni-NTA纯化重组蛋白并评价其活性;分析GgTrx2对脂多糖(LPS)诱导的鸡肝细胞氧化应激的影响。结果显示,构建的原核表达载体pET-28a(+)-GgTrx2在37℃经1.0mmol/L IPTG诱导4h蛋白表达效果最好,经Ni-NTA柱纯化后纯度达90%以上,质量浓度为5.0mg/mL。该重组蛋白具有较高的还原胰岛素二硫键的能力,并呈现浓度效应。抗氧化功能分析表明,GgTrx2预处理能显著降低LPS诱导的鸡肝细胞膜脂过氧化和保护抗氧化酶SOD和CAT的活性。结果表明,本研究原核表达的GgTrx2蛋白具有良好的生物学活性和抗氧化应激特性,为进一步阐明其生物学功能和用于治疗氧化应激性疾病奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒(ARV)P17非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV S1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0.2 mmol/LIPTG诱导,表达的融合蛋白分子质量为42.4 ku,占菌体总蛋白的34%。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后,纯度达到85%。Western-blotting显示,纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应,说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。     

番鸭呼肠孤病毒YB株NS基因的序列分析及原核表达

为实现番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株NS非结构基因的克隆分析及原核表达,首先经RT-PCR扩增NS基因的完整编码序列(CDS),并将其克隆到p ET-32a(+)载体中。测序后对获得的NS基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。测序结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株NS基因的原核重组质粒p ET-YB-NS,并获取了NS基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB NS基因的CDS大小为1 908 bp,编码635个氨基酸;该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为98.2%~99.4%。遗传进化树分析显示,MDRV-YB株处于传统型MDRV分支上。该蛋白氨基酸序列中并不含有潜在的信号肽序列,但是含有2个潜在的N-糖基化位点以及61个磷酸化位点。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,成功高效表达出分子质量约为88.7 ku的融合蛋白(p-NS),表达时IPTG最佳诱导时间、浓度和温度分别为5 h、0.4 mmol/L和36℃。Western-blot结果显示,表达的p-NS蛋白能特异性识别MDRV阳性血清,表明表达产物具备良好的反应原性。上述结果表明,MDRV NS非结构基因的克隆分析及其蛋白表达的实现,为进一步研究MDRV NS蛋白功能奠定了基础。     

鸭源呼肠孤病毒DRV-GZ株S2基因的序列分析及其表达

采用RT-PCR方法从鸭源呼肠孤病毒DRV-GZ株中扩增出了S2基因片段,将其克隆到表达载体pET-28a( )中,测序验证后转化入表达宿主茵RosettaTM2(DE3)plysS,进行IPTG诱导表达.结果表明,重组菌可表达出相对分子质量约为50000的重组融合蛋白,在浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导4 h的情况下表达效果最好.表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中.表达产物经Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白.经Western-blot分析,所纯化的蛋白能与抗呼肠孤病毒DRV-GZ株阳性血清进行特异性的免疫印迹反应,证实表达的蛋白具有较好的反应原性.     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因和牛α-干扰素基因的融合表达

将AsiaⅠ型口蹄疫病毒YNBS/58株VP1基因和去信号肽的牛α-干扰素基因共同亚克隆于原核表达载体 pET-28a中,转化 BL21 后经 IPTG诱导,实现了重组融合蛋白 VP1-BoIFN -α在大肠埃希氏菌 BL21 中的高效表达,表达产物经 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析,重组的VP1-BoIFN-α蛋白分子质量约为 46 ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示,重组蛋白 VP1-BoIFN-α的表达量占菌体总蛋白的30%,且以包涵体的形式存在。包涵体提取物用 8 mol/L尿素溶解后,在变性条件下利用Ni-NTA柱对VP1-BoIFN-α融合蛋白进行了纯化。     

鸡毒霉形体H3株TM-1基因与鸡白细胞介素2基因串联子在大肠杆菌中的共表达

运用DNA重组技术将鸡白细胞介素2基因和鸡毒霉形体H3株TM-1基因进行串联,插入到pET-30a( )质粒的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点间,经PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定,表明已成功构建了含鸡毒霉形体H3株TM-1基因和鸡白细胞介素2基因的融合基因,将含有此融合基因的重组质粒命名为pET-30a( )-TM-1-IL-2。将此重组质粒转化E.coliBL21(DE3)菌株。经IPTG 37℃诱导表达4 h后,SDS-PAGE电泳结果显示,此融合基因得到了表达,所表达出的融合蛋白的分子质量约为43 ku,主要以包涵体形式存在。表达产物在尿素存在下经超声波处理,获得了纯化的融合蛋白。这为进一步研究鸡白细胞介素2及鸡毒霉形体的生物学活性奠定了基础。     

鸡肺表面活性蛋白A的可溶性表达及活性检测

利用RT-PCR扩增鸡肺表面活性蛋白A(cSP-A)基因,将其连接pMD19-T Simple载体,经测序正确后,扩增成熟肽基因片段并酶切克隆入pCold-TF原核表达载体中,转化到感受态宿主菌BL21(DE3)中,加入不同浓度异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)于16℃诱导表达24h,超声波裂解,通过His·Tag纯化试剂盒纯化,分别进行SDS-PAGE检测。结果扩增得到615bp的成熟肽基因片段;SP-A蛋白获得可溶性表达,融合蛋白的大小为80ku。Western-blot结果显示,该蛋白可被特异性多克隆抗体识别。抑菌试验结果显示,与纯化的天然cSP-A蛋白不同,cSP-A原核表达产物并不具备抑菌活性。     

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3.1-pIL-18为模板,采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18(IL-18)的成熟蛋白基因,通过KpnⅠ SacⅠ双酶切及连接反应,构建了pET32c-pIL-18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中的基因片段连接正确。之后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为33 ku处出现了预期的目的蛋白。用8 mol/L脲对表达产物变性,经Ni2 -NTA柱纯化,透析复性,得到了纯化的IL-18蛋白。Western-blot分析证实,纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

鹅细小病毒野毒株VP3基因的原核表达及抗原性检测

根据发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列设计合成了2对检测GPV的特异性引物,用其对疑似小鹅瘟的病料进行PCR检测,经序列比对后确定为GPV感染;利用引物Gs/Ga扩增获得的GPV野毒株VP3基因,测序后将VP3基因连接到原核表达载体pET-30a上,获得重组质粒pET-30a-VP3,将其转化感受态菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析.结果显示,重组菌可表达出分子质量约为66 000 u的重组融合蛋白,表达的蛋白以包涵体形式存在于菌体中.表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,获得了纯度较高的目的蛋白.Western-blot分析结果显示,纯化的蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,证实表达的蛋白具有较好的抗原性.     

多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。     

鸡传染性贫血病毒VP1基因的克隆表达及抗原性分析

参考已发表的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP1基因序列,设计并合成了2对引物,经PCR扩增获得了2个基因片段。将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体中,成功构建了克隆载体pGEM-CIAVVP1A和pGEM-CIAVVP1B。将上述重组质粒和原核表达载体pMXB10分别用NdeⅠ+EcoRⅠ、NdeⅠ+XhoⅠ双酶切,并将纯化的2个基因亚克隆至pMXB10中,构建出原核表达载体pMXB10-VP1A和pMXB10-VP1B。在0.3 mmol/L IPTG诱导下,目的基因在大肠杆菌ER2566中以分泌型得到了大量表达。Western-blot分析发现,表达蛋白具有CIAV抗原性。表达蛋白经纯化后作为包被抗原,用间接ELISA鉴定,与CIAV阳性血清均能发生特异性反应。2组蛋白免疫SPF鸡后,用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性,表明2组蛋白均可诱发机体产生抗CIAV的抗体。     

鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达

参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物.通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/Ⅴ结构蛋白VP3基因,并将VP3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS.SDS-PAGE分析表明,经用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52 ku的目的蛋白条带.Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性.     

弓形虫RH株热应激蛋白40基因的克隆与原核表达

为研究弓形虫热应激蛋白40(TgHSP40)的生物学特性,采用RT-PCR方法从弓形虫RH株中扩增出TgHSP40基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)后转化入表达菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,应用Western-blot对重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,重组菌可表达出分子质量约46ku的重组融合蛋白,在37℃、IPTG浓度为1.0mmol/L、诱导6h的情况下表达效果最好。重组蛋白经纯化后进行的Western-blot分析证实,表达、纯化的弓形虫RH株HSP40蛋白具有良好的反应原性,与弓形虫基因Ⅰ型的RH株、基因Ⅱ型的PRU株以及基因型为ToxoDB9的TgC7株和GJS株的阳性血清均可发生特异性反应,预期可作为弓形虫病ELISA诊断方法的候选抗原。本研究结果为弓形虫病新型诊断方法的建立奠定了基础。     

猪环鸟苷酸-腺苷酸合成酶cGAS基因的原核表达及其表达产物的生物活性分析

为获得具有生物学活性的环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)蛋白与第二信使分子2′3′-cGAMP,构建了猪源cGAMP合成酶pcGAS基因的原核表达载体pET-28a-SUMO-pcGAS,将其转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),并通过优化诱导条件实现了可溶性表达;利用镍柱亲和层析对表达的重组蛋白产物进行初步纯化,随后切除SUMO标签蛋白,再用亲和层析进一步纯化,获得了纯度较高的重组蛋白pcGAS;将获得的重组蛋白pcGAS通过体外酶促反应生物合成了2′3′-cGAMP,且合成产物能够诱导启动细胞Ⅰ型IFNs的产生。结果表明,pcGAS重组蛋白和2′3′-cGAMP均具有生物活性,这为后续抗病毒、抗肿瘤药物以及免疫增强剂的开发奠定了基础。