维氏气单胞菌胞外产物免疫反应蛋白的筛选

为筛选维氏气单胞菌胞外产物的免疫反应蛋白,提取维氏气单胞菌TH 0426株胞外产物,利用双向电泳技术对其进行分离,比对蛋白胶与免疫印迹膜上的蛋白反应点,进行质谱鉴定。结果显示,应用免疫蛋白质组学方法筛选维氏气单胞菌胞外产物免疫反应蛋白,共得到24个免疫反应蛋白点,成功鉴定18个,经分析为11种蛋白,分别是肽酶S8、长链脂肪酸转运蛋白、溶血素样毒素、膜蛋白、主要外膜蛋白O mp AⅠ、麦芽糖、ABC底物结合转运蛋白和几种假定蛋白。本研究结果为维氏气单胞菌疫苗的研制奠定了基础。     

不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因的克隆及比较研究

为系统研究维氏气单胞菌外膜蛋白AⅠ(OMPAⅠ),对不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因进行了克隆,获得了1 000 bp左右的目的基因,并对其序列进行了比较分析。结果显示,不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因的核苷酸序列均具有OMP_b-brl和OmpA_C-like保守结构域,其核苷酸序列同源性在93.6%以上,说明不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ具有一定的保守性。研究结果为维氏气单胞菌疫苗的研制提供了一定的理论依据。     

狐源维氏气单胞菌体内诱导基因的筛选

为了筛选狐源维氏气单胞菌体内诱导基因,本研究将狐源维氏气单胞菌人工感染家兔,并取不同感染时期的血清混合,分别用体外培养的维氏气单胞菌和大肠杆菌BL21全菌、二者菌体裂解物以及热变性裂解物进行吸附,用ELISA进行检测;同时构建狐源维氏气单胞菌基因组的p ET系统重组质粒表达文库。再用经吸附处理的血清对狐源维氏气单胞菌基因组文库进行菌落原位免疫杂交筛选,将筛选的阳性克隆进行测序,并用RT-PCR进一步验证。结果显示,最终获得8个狐源维氏气单胞菌的体内诱导基因,分别为GTP焦磷酸激酶基因、转录调控基因Mar R基因、氢化酶细胞膜亚基基因、外膜受体转运蛋白Ton B基因、Ⅲ型分泌系统asc V基因以及3个保守假想蛋白基因。研究结果为维氏气单胞菌保护性抗原的筛选、分子致病机制及跨物种间传播机制奠定了基础。     

不同宿主来源的维氏气单胞菌外膜蛋白AⅡ基因的克隆及比较

为探讨外膜蛋白AⅡ(OMPAⅡ)作为维氏气单胞菌共同保护性抗原的可能性,对不同宿主来源的维氏气单胞菌OMPAⅡ基因进行了克隆,获得了1 100bp左右的目的基因,并利用多种生物学软件对其序列进行了比较。结果表明,不同宿主来源的维氏气单胞菌OMPAⅡ基因序列的同源性在95.1%以上,编码氨基酸序列的同源性在97.3%以上,而且所有分析序列均具有明显的保守结构域,说明不同宿主来源的维氏气单胞菌OMPAⅡ具有很高的保守性;相对于ATCC35624和YP004393583.1来说,它们之间的差异主要表现在,CVCC3700、QXF、WL161、NJ34、NN725和BAF63175.1的OMPAⅡ基因缺失了3个碱基(CAA)。本研究结果为OMPAⅡ作为维氏气单胞菌基因工程亚单位疫苗候选成分提供了一定的理论依据。     

维氏气单胞菌rpoN基因缺失株的构建及部分生物学特性分析

为了研究rpoN基因对维氏气单胞菌致病性的影响,采用同源重组的方法构建该基因缺失株。以该菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增rpoN基因的上、下游同源臂;以上、下游同源臂胶回收产物为模板,P1-1/P2-2为引物进行重叠PCR扩增相应目的片段,从而获得rpoN上下游同源臂连接片段;将获取的连接片段连接pRE112,将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取重组质粒pRE112-rpoN,经同源重组和抗生素筛选获得维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN。同时,依然利用重叠PCR将目的基因片段与启动子相连接,而后与质粒p BBR-MCS相连接,最后将重组质粒pBBR-MCS-rpoN转化至缺失株ΔrpoN中,构建互补株C-rpoN。PCR鉴定和测序结果显示,成功构建出维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN和互补株C-rpoN。生物学特性分析试验结果表明rpoN的缺失导致维氏气单胞菌TH0426菌落形态改变、生物被膜形成能力下降、动物致病性减弱,鞭毛断裂,运动性丧失。本研究中成功构建了维氏气单胞菌TH0426株rpoN基因的缺失株ΔrpoN,为进一步研究维氏气单胞菌减毒疫苗和rpoN基因的功能奠定了基础。     

团头鲂致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定长春市某水产养殖场团头鲂的病原菌,从患病团头鲂体内分离到致病菌JWC086,对其形态和生理生化特性进行了鉴定,并对16S r DNA和管家基因gyr B序列、毒力基因携带情况及耐药性进行了分析。结果显示,该菌为革兰阴性菌,其生理生化特性与维氏气单胞菌基本相同。16S r DNA序列比对结果表明,该菌与维氏气单胞菌(KP716691)的同源性在99%以上。基于16S r DNA与gyr B序列的进化分析显示,该菌与维氏气单胞菌同属一个分支,同源性较高。将分离菌人工感染团头鲂,7 d内团头鲂全部死亡,且临床症状与自然病例相似。通过毒力基因检测发现,能从JWC086扩增出气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(Aha)、丝氨酸蛋白酶(ser)、核酸酶(exu)、脂肪酶(lip)及密度感应系统调控基因(Lux S)等7种毒力因子。药敏试验结果显示,该菌对氟苯尼考及复方新诺明等药物比较敏感。本研究为团头鲂感染维氏气单胞菌的鉴定及治疗提供了科学依据。     

鲫鱼源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

为鉴定长春市某渔场鲫鱼病原菌,从患病鲫鱼脾中分离到病原菌J YX-1,通过生理生化试验,16S rRNA、管家基因及毒力基因扩增,系统发育分析和药敏试验进行鉴定。结果显示,分离菌J YX-1对鲫鱼具有致病性;基于16Sr RNA与4种管家基因构建的系统发育树显示,该菌与维氏气单胞菌同属一个分支,亲缘关系较近,表明J YX-1为维氏气单胞菌;毒力基因检测发现,能从J YX-1扩增出气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(Aha)、丝氨酸蛋白酶(ser)、核酸酶(exu)及脂肪酶(lip)6种毒力因子基因。药敏试验结果显示,分离菌J YX-1对克拉霉素、妥布霉素及链霉素等11种药物敏感。本研究结果为鲫鱼感染维氏气单胞菌的鉴定及治疗提供了理论依据。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp基因缺失株的构建及其部分生物学特性分析

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的致病机制,在全基因测序的基础上,通过同源重组缺失脂蛋白基因。首先扩增脂蛋白基因的上下游同源臂,通过重叠PCR连接后,凝胶回收DNA片段;连接克隆载体pMD18-T,转化DH5α感受态细胞,测序成功后提取质粒进行双酶切,连入相同酶切的Pre112自杀性质粒;依次转化DH5α-λpir、WM3064感受态细胞,作为供体菌;和受体菌野生株进行同源重组,并筛选鉴定。结果显示,成功缺失了维氏气单胞菌脂蛋白基因。生物学特性分析结果发现,缺失株和野生株的生长速度相似,生物膜形成能力降低,鞭毛缺失,游动能力减弱,细菌的毒力降低,溶血活性没有明显变化。因此,成功构建了维氏气单胞菌脂蛋白基因缺失株,并分析了其部分生物学特性,为进一步研究脂蛋白基因的功能奠定了一定的基础。     

维氏气单胞菌TH0426株ndk基因缺失株的构建与生物学特性分析

为研究维氏气单胞菌ndk基因的功能,利用自杀性质粒pRE112通过同源重组的方法缺失ndk基因,然后对野生株和缺失株的生长能力、运动性、生物被膜形成能力及LD50等进行差异分析。经过PCR以及荧光定量PCR表达水平证明ndk基因缺失成功;生物学特性研究显示,缺失株的生长能力和泳动性均下降;生物被膜形成能力与野生株相比差异极显著(P0.001);与野生株相比,LD50升高了5.5倍,且差异极显著(P0.001)。由此可以推测,ndk基因与维氏气单胞菌的毒力及生物被膜形成密切相关。本研究结果为维氏气单胞菌致病机制的研究奠定了基础。     

维氏气单胞菌胞外产物HisJ基因的克隆与生物信息学分析及原核表达

为研究维氏气单胞菌胞外产物HisJ基因的可能相关功能,扩增HisJ基因,并通过同源性比较构建HisJ基因的系统进化树,利用相关软件对HisJ基因编码的蛋白进行生物信息学分析,并对HisJ基因进行原核表达以及表达产物的免疫原性进行检测。结果显示,HisJ基因全长774 bp,编码247个氨基酸,TH0426株HisJ与维氏气单胞菌属同一分支,具有信号肽、跨膜区,属于膜外蛋白,二级结构主要以α螺旋、无规则卷曲为主。经SDS-PAGE分析发现,重组菌可表达出融合性蛋白,并且以10‰的体积接菌、IPTG终浓度为1.0mmol/L诱导8 h表达效果最好。Western-blot分析结果显示,重组HisJ蛋白在大肠杆菌中被成功表达且能被小鼠抗HisJ蛋白血清识别,表明表达的HisJ蛋白具有一定的免疫原性。为进一步对HisJ蛋白的结构功能及与致病性、耐药性关系的研究奠定了基础。     

斑点叉尾鮰维氏气单胞菌病的病理组织学观察

应用无菌操作技术,从患病的斑点叉尾鮰肝、肾中分离病原菌,并进行生理、生化鉴定。同时通过病理切片和HE染色技术,观察由维氏气单胞菌引起的自然发病斑点叉尾鮰的肝、肾、脾、肠、脑、鳃等器官的病理组织学变化。结果显示,从患病鱼的肝、肾中分离到形态、大小一致的细菌,经鉴定为维氏气单胞菌。镜下可见患病叉尾鮰肝细胞严重空泡变性,部分区域肝细胞坏死、溶解,相互融合成溶解性坏死灶;肾小球毛细血管严重充血,充满大量红细胞,肾小囊扩张,肾间质严重出血,拟淋巴细胞及造血组织减少,大量含铁血黄素及单核细胞、嗜中性粒细胞等炎性细胞浸润;脾出血,淋巴细胞减少,大量含铁血黄素及红细胞浸润;肠黏膜下层和浆膜层水肿,小血管和毛细血管充血;脑浆膜和基质水肿;鳃小片毛细血管严重充血,基部细胞增生,呼吸上皮浮离,有的呼吸上皮细胞和柱细胞变性、坏死,使部分鳃小片腐离脱落。表明,维氏气单胞菌可引起斑点叉尾鮰多器官组织,特别是肝、肾、脾、脑、鳃等重要功能器官出现典型的病理变化并引起死亡。     

中国大鲵维氏气单胞菌病的组织病理学观察

运用病理切片和HE染色技术,对维氏气单胞菌自然感染大鲵的肌肉、肝、肾、肺、肠道等器官的组织病理学变化进行了观察。结果显示,肝可见大量淋巴细胞和少量中性粒细胞,肝细胞空泡状变性,肝血窦内见大量血细胞;肾集合管中可见少量蛋白样物,血管球扩张,有的溶解坏死;心肌纤维溶解,甚至坏死,可见充血和出血;胰细胞颗粒变性;肺偶见充血;脾索排列紊乱,脾窦中充满大量红细胞和巨噬细胞;肠道内肠绒毛溶解脱落,有充血现象;肌纤维蜡样坏死,肌细胞核浓缩凝固,深染,破碎。证实,维氏气单胞菌能使中国大鲵的多个组织器官出现严重的病理变化而导致死亡。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp/LppB双基因缺失株的构建与验证

在维氏气单胞菌单基因缺失株ΔLpp的基础上,通过同源重组方法获得脂蛋白LppB基因上、下游同源臂连接片段,依次构建重组克隆载体pMD18-T-L-UD1225和重组自杀性载体Pre112-L-UD1225,随后转入WM3064感受态细胞中作为供体菌,与受体菌ΔLpp进行结合转移,构建双基因缺失株ΔLpp/LppB,通过反转录验证并检测其遗传稳定性。结果显示,成功构建了遗传稳定性良好的双基因缺失株ΔLpp/LppB,其生长速率和生物被膜形成能力较野生株WT均下降。结果表明,协同缺失脂蛋白基因Lpp和LppB后,双基因缺失株ΔLpp/LppB的生长和生物被膜变化更显著,这有利于进一步推测脂蛋白基因的功能,为之后研究维氏气单胞菌的致病机制奠定了基础。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp/LppB双基因缺失株的构建与验证

在维氏气单胞菌单基因缺失株ΔLpp的基础上，通过同源重组方法获得脂蛋白LppB基因上、下游同源臂连接片段，依次构建重组克隆载体pMD 18-T-L-UD1225和重组自杀性载体Pre112-L-UD1225，随后转入WM3064感受态细胞中作为供体菌，与受体菌ΔLpp进行结合转移，构建双基因缺失株ΔLpp/LppB，通过反转录验证并检测其遗传稳定性。结果显示，成功构建了遗传稳定性良好的双基因缺失株ΔLpp/LppB，其生长速率和生物被膜形成能力较野生株WT均下降。结果表明，协同缺失脂蛋白基因Lpp和LppB后，双基因缺失株ΔLpp/LppB的生长和生物被膜变化更显著，这有利于进一步推测脂蛋白基因的功能，为之后研究维氏气单胞菌的致病机制奠定了基础。     

维氏气单胞菌OmpAⅠ基因重组植物乳杆菌的构建及其表达产物的免疫原性分析

为构建维氏气单胞菌OmpAⅠ基因重组植物乳杆菌并检测其表达产物的免疫原性,将目的基因克隆至大肠杆菌-乳杆菌穿梭表达载体p SIP409中,并电转至植物乳杆菌中,经诱导后对表达产物进行Western-blot分析。结果显示,LP/p SIP409-OmpAⅠ重组植物乳杆菌出现一条约42 ku的印迹,与预期大小相符,表明重组蛋白具有反应原性。LP/p SIP409-OmpAⅠ重组植物乳杆菌免疫鲫鱼后,在第25天血清中Ig M水平达到高峰;RT-PCR检测发现免疫后鲫鱼肝、脾、肾及心组织中的细胞因子IL-8、IFN-γ与IL-1β表达水平均有不同程度提升;攻毒后LP/p SIP409-OmpAⅠ免疫组的保护率在65%以上,高于对照组的存活率。结果表明,应用重组植物乳杆菌LP/p SIP409-OmpAⅠ免疫鲫鱼能刺激机体产生免疫应答反应,为预防鱼类维氏气单胞菌感染的重组植物乳杆菌口服制剂的研发奠定了基础。     

蟒蛇气单胞菌病的病原鉴定

对一患严重口炎的蟒蛇进行病原分离与鉴定,结果从病灶部分离出4株嗜温、有动力气单胞菌,其中3株为温和气单胞菌,1株为豚鼠气单胞菌是致蟒蛇口炎及死亡的病原.     

草鱼肠炎的病原菌检验与分析

对２个鱼场的５尾病（死）鱼的肠内容物及肝进行细菌学检验,在其中２尾病死鱼及１尾病鱼的肝中发现形态特征一致的细菌,并分离到菌落特征基本一致的细菌;在５尾鱼的肠内容物中均发现并分离到几乎纯一的与肝中相同的细菌。经对２４株纯培养菌理化特性鉴定,初步表明分离菌为气单胞菌属的嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、温和气单胞菌（Ａ．ｓｏｂｒｉａ）及豚鼠气单胞菌（Ａ．ｃａｖｉａｅ）,其中以嗜水气单胞菌占优势。回归试验表明,分离鉴定的３种气单胞菌均有致病性。     

市售淡水鱼肠内气单胞菌及类志贺邻单胞菌的调查

对市售的６种淡水鱼共采肠内容物样品７３份，检出气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）３２株，阳性率为４３．８４％；类志贺邻单胞菌（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）１７株，阳性率为２３．２９％。其中有８份样品同时检出上述两菌。对３２株气单胞菌用８项生化试验鉴定为４个种，分别是嗜水气单胞菌（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ）１６株，豚鼠气单胞菌（Ａ．ｅａｖｉａｃ）８株，温和气单胞菌（Ａ．ｏｂｒｉａ）７株，简达气单胞菌（Ａ．ｊａｎｄｅｉ）１株。     

罗非鱼源无乳链球菌双重PCR快速检测方法的建立

根据GenBank中罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖的cpsF基因和CAMP因子的cfb基因序列,设计2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,并进行特异性试验、敏感性试验及人工感染罗非鱼组织样品检测,建立了快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。结果显示,仅无乳链球菌能扩增出cpsF和cfb两条特异性条带,而海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌无条带检出;经敏感性试验,最小模板检出量为7.632×10-2ng/μL;同时对30尾人工感染无乳链球菌的罗非鱼肝和肾组织中细菌DNA进行双重PCR检测和细菌分离鉴定,检出的阳性结果一致。证实,所建立的方法具有快速、特异、灵敏的优点,适用于对罗非鱼等无乳链球菌的感染病例进行流行病学监测。     

嗜水气单胞菌胶体金快速检测试纸条的研制

用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒,标记抗嗜水气单胞菌单克隆抗体并制备金标垫。将吸收垫、喷涂有抗嗜水气单胞菌单克隆抗体和羊抗鼠抗体的硝酸纤维素膜、金标垫及样品垫组装成免疫层析试纸条,建立嗜水气单胞菌的胶体金免疫层析快速检测方法。用灭活细菌与血清混合的模拟检测样本测定试纸条的特异性、灵敏度,结果显示:试纸条对豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌等13种常见病原菌没有交叉反应,与嗜水气单胞菌有特异性反应,检测灵敏度为1×105CFU/mL,检测时间小于5min。所制备的嗜水气单胞菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高、适用于基层临床生产推广应用等优点。