18例案件物证Amp—FLP检测分析

80年代中期建立的聚合酶链反应(PCR)技术,以基因组DNA为模板在DNA聚合酶催化作用下,由一对寡核苷酸引物引导,在体外扩增靶DNA片段。经过约30个循环反应,靶DNA片段可扩增100万个拷贝。PCR技术使法医物证检验的灵敏度大为提高,达到纳克级DNA的超微量水平。近10年来,PCR技术在法医界迅速得以推广与使用,被称为第二代DNA分型技术。人类基因组内可变数目串联重复序列(VNTR)位点具有极高多态性,VNTR位点和片段长度等位基因多达数十,甚至数百。运用PCR技术扩增VNTR位点并经片段长度多态     

法医DNA分型 第一讲 DNA多态性基本原理

DNA (脱氧核糖核酸 )是生物遗传物质。DNA分型技术在法医物证鉴定中应用日益广泛 ,在各类重大刑事案件的侦破中发挥了越来越重要的作用。近 10多年 ,是法医学发展最快的时期 ,DNA分型技术跨了两大步 :1985年建立的第一代分型技术———DNA指纹 ,实现了物证鉴定从否定到认定的历史性转变 ;进入 90年代 ,PCR (聚合酶链反应 )技术问世 ,可以在体外完成扩增复制靶DNA片段的全过程 ,是生命科学一项划世纪的进展。以PCR为基础的第二代DNA分型技术在检测灵敏度上有重大突破 ,解决了半个多世纪以来困扰法医的微量、陈旧、腐败检材鉴定的难题。DNA分型的高科技 ,以其无可争议的认定或否定的鉴定结论 ,为法庭提供确凿的证据 ,成为打击犯罪的有力武器。从本期起 ,对《法医DNA分型》进行专题讲座 ,将分期介绍DNA多态性基本原理 ,DNA分型结论的评估 ,法医DNA分型技术与方法 ,以及DNA分析技术展望等四个部分 ,以飨读者     

STR联合扩增鉴定碎尸案1例

聚合酶链反应（PCR）技术于1985年由美国Cetus公司的RandallSaiki、HenryErlich和KaryMullis等联合创建[1]。人类基因组DNA有3×109bp，其中10％是串联重复序列，被称为卫星DNA。卫星DNA按重复单位的长短分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中微卫星重复单位仅由2～7hp组成，故又称为短串联重复序列（STR）。Saihi等人发现人类STR可用PCR方法扩增[2]，并且有高度多态性[3]。作者成功地利用PCR扩增PLA2A、VWA、CYP19、TH01、LPL、D6S366、D19S253、FESFPS八个STR位点对一例碎尸案中尸块做同一认定及尸源鉴定，现…     

HUMARA基因座差异甲基化的法医学意义

目的　探讨X连锁差异甲基化多态性基因座的法医学应用意义。方法　以STR基因座HUMARA为例 ,应用甲基化敏感性限制酶消化后PCR技术 ,复合分析该基因座的STR多态性和甲基化状态 ,调查并比较男、女检材的分型效果。结果　基因组DNA经HpaⅡ消化后 ,男性没有扩增产物 ,女性分型不受影响 ,男女混合检材得到女性的分型图谱。女性单克隆瘤细胞只能检出 1个等位基因。结论　差异甲基化的HUMARA基因座是混合斑分析、性别鉴定和组织克隆性判断的有用工具。     

多重置换扩增技术用于法医学微量DNA检测效果

目的探讨多重置换扩增(MDA)技术对法医学微量DNA样品STR检测分型的效果。方法用MDA技术对不同模板量DNA进行全基因组扩增(WGA),扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用Profiler PlusTM试剂盒检测基因型。结果该方法可对模板DNA增加104～106倍。1ng样品DNA的MDA产物可获得9个STR基因座和Amelogenin性别基因座的准确分型结果;低于0.1ng的样品DNA经MDA扩增后,基因座检出数增加,但可见等位基因不平衡或丢失现象。结论MDA技术可有效增加DNA模板量和提高微量DNA分型效果。但样品DNA量低于0.1ng时,MDA产物的STR分型结果判读须慎重。     

对指甲进行STR检测的可行性

STR(短串联重复序列)是人类基因组中具有高度多态性的遗传标记,它以3～7个bp为基本单元,在同一位点上因重复数的不同而形成不同的等位基因,STR位点因其序列短,扩增成功率高,对降解及微量检材具有特殊价值,因而在法医检验上得到了广泛应用。目前,大部分人体生物样品可通过消化的方式裂解细胞以获取足够量的模板DNA进行STR分型,指甲等硬组织核DNA提取相对困难,没有现成的方法或试剂盒。作者参照Kane等人报道的方法[1,2],通过高浓度的DTT打开角化蛋白中的二硫键使PK得以对指甲进行消化,从而获得核DNA,得到了令人满意的STR分型结果。…     

印记基因KCNQl的遗传多态性及在亲权鉴定中的应用

目的 为了调查印记基因KCNQl的STR位点在中国汉族人群中的遗传多态性,利用亲源印记等位基因(parentally imprinting allele,PIA)分型法确定孩子的等位基因亲代来源,为亲权鉴定提供新的侯选STR位点.方法 应用Chelex法提取153例佳木斯地区汉族健康无血缘关系个体DNA,用QIAamp Blood l(jt(Qiagen)法提取3个家庭10个个体DNA,PCR扩增,凝胶电泳分型,ABlPRIsMTM3730xL DNA测序仪测序;甲基化敏感性限制性内切酶消化孩子基因组DNA,PCR扩增,确定孩子等位基因的亲代来源.结果 发现在中国佳木斯地区汉族人群中KCNQ1基因的STR有7个等位基因,多态信息含量为0.662,且KCNQI基因的STR位点呈父源印记.结论 印记基因KCNQl的STR位点有很好的多态性.可为亲权鉴定提供新的侯选遗传标记,其亲源特异性甲基化标记有望应用于单亲鉴定中.     

印记基因KCNQ1的遗传多态性及在亲权鉴定中的应用

目的为了调查印记基因KCNQ1的STR位点在中国汉族人群中的遗传多态性，利用亲源印记等位基因（parentally imprinting allele，PIA）分型法确定孩子的等位基因亲代来源，为亲权鉴定提供新的侯选STR位点。方法应用Chelex法提取153例佳木斯地区汉族健康无血缘关系个体DNA，用QIAamp Blood Kit（Qiagen）法提取3个家庭10个个体DNA，PCR扩增，凝胶电泳分型，ABIPRISM^TM 3730XL DNA测序仪测序；甲基化敏感性限制性内切酶消化孩子基因组DNA，PCR扩增，确定孩子等位基因的亲代来源。结果发现在中国佳木斯地区汉族人群中KCNQ1基因的STR有7个等位基因，多态信息含量为0．662，且KCNQ1基因的STR位点呈父源印记。结论印记基因KCNQ1的STR位点有很好的多态性，可为亲权鉴定提供新的侯选遗传标记，其亲源特异性甲基化标记有望应用于单亲鉴定中。     

D8S1179位点扩增不平衡

短串联重复（shorttandemrepeat，STR）是目前法医学上个体识别中应用最广泛的遗传标记。STR的分型多数采用扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlengthpolymorphism，Amp－FLP）分型技术。由于各种原因，不同的STR等位基因的PCR扩增效率并不总是相等，使杂合子个体的两个等位基因间可能出现扩增不平衡的现象。本文报道４例D８S１１７９位点扩增不平衡的现象。１材料与方法１．１标本来源４个血样本的DNA用酚／氯法提取。１．２D８S１１７９位点的分型１．２．１聚丙烯酰胺凝胶银染法检测引物按照STRBase（http：／／www．cstl…     

多重置换扩增技术用于法医学微量DNA检测效果

目的探讨多重置换扩增（MDA）技术对法医学微量DNA样品STR检测分型的效果。方法用MDA技术对不同模板量DNA进行全基因组扩增（WGA）．扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用Prrfiler Plus^TM试剂盒检测基因型。结果该方法可对模板DNA增加10^4～10^6倍。1ng样品DNA的MDA产物可获得9个STR基因座和Amelogenin性别基因座的准确分型结果；低于0．1ng的样品DNA经MDA扩增后，基因座检出数增加。但可见等位基因不平衡或丢失现象。结论MDA技术可有效增加DNA模板量和提高微量DNA分型效果。但样品DNA量低于0．1ng时，MDA产物的STR分型结果判读须慎重。     

改良IPEP法用于痕量DNA检测的实验研究

目的探讨改良扩增前引物延伸(IPEP)法对痕量DNA样本STR检测分型的效果。方法用改良IPEP法对痕量样品DNA进行全基因组扩增(WGA),扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用AmpFLSTR~ Indentifiler~试剂盒作基因型检测。结果该方法可增加模板DNA约200~1100倍。基因组DNA不低于0.025ng时,可获得15个STR基因座和Amelogenin性别基因座的分型结果。基因组DNA0.01~0.025ng时,可获得9个以上基因座的分型结果。结论改良IPEP法可有效提高痕量DNA样本STR分型检验的灵敏度,有较好的实用价值。     

复合扩增9个STR位点在亲子鉴定中的应用评估

在法医学亲子鉴定中应用复合扩增及四色荧光自动分析技术检测 Profiler plusTM9个 STR位点,一次性获得的信息量大,累计非父排除率达 0.9999。应用于 268例亲子鉴定的结果表明, 9个具有高度多态性 STR基因座的联合检测,能使三联体亲子鉴定的排除结论明确无误。对不排除案例,其 RCP值均可达国际认定标准。对二联体亲子鉴定一般需增加 CofilerTM试剂盒 4个 STR位点检测。     

短串联重复vWFⅢ扩增片段长度多态性在法医学应用的可行性研究

目的探讨STR位点vWFⅢ用于法医学鉴定中的实用价值。方法应用聚合酶链式反应（PCR），聚丙烯酰胺凝胶电泳结合染银显带的分离方法对STR位点vWFⅢ扩增片断长度多态性进行研究。结果经过优化筛选掌握了该位点的最适扩增条件，其对各类检材均获得稳定可靠的扩增产物。本方法的灵敏度达10pg基因组DNA、0．5μl全血、1μl新血痕、0．1μl精液、0．2μl新鲜精斑。结论本方法快速、灵敏、准确，在法医学个人识别和亲子鉴定中具有推广应用的价值。     

PCR扩增STR位点在强奸案中的应用

利用Chelcx－100、PK、SDS、DTT对精液和阴道液、精液和血液混合班进行处理，除去女性阴道上皮细胞和血细胞获得精于细胞，提取DNA，经扩增STR位点[1]，获得高度多态性l‘ISTR位点分型图，与同一个体血液DNA的STR位点分型比较计算其概率，达到个体认定的作用．对强奸致孕案，由于STh位点等位基因按孟德尔遗传规律由亲代向子代传递，在母亲是肯定的情况下，可把STR位点分型与嫌疑父亲进行对比，计算其RCP父权相对机会）值认定嫌疑父亲为生物学父亲．通过对多起强奸案混合斑和强奸致孕案的实际应用，成功地排除或认定了罪犯，现…     

国内外“DNA数据库”遗传学标志的比较研究

目的通过英、美、中"DNA数据库"遗传学标志的比较,探寻我国大规模建库宜用的STR位点.方法用复合PCR扩增和四色荧光技术对我国汉族群体进行基因型检测,获得D2S1338、D19S433、CODIS等15个STR位点的多态性分布资料,并结合目前国内外法医学者报道的其它STR位点进行比较分析.结果Profiler Plus试剂盒中的STR位点和D16S539、D2S1 338、D19S433、Penta D、Penta E任中国人群中有重要应用价值.结论为便于建立DNA实验室技术标准和质控标准,提倡开发和使用适合我国人群的商品化STR检测试剂盒.     

23个STR基因座荧光复合扩增体系的法医学应用评估

目的评估新建立的23个STR复合扩增体系EX23的法医学应用价值。方法使用磁珠法提取样本DNA,应用23个STR复合扩增体系进行扩增,ABI3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID 3.2软件进行基因分型,对法医学应用参数、灵敏度、种属、脱落细胞检材及降级检材分型效果进行观察,并与Sinofiler试剂盒比较。结果 DNA模板量在0.05~1.00ng时,各基因座分型结果清晰准确,均衡性好、特异性强。应用该复合扩增体系检验混合样本、降解检材及脱落细胞检材,均能获得正确的分型结果。统计结果显示该23个STR基因座累计个人识别（TDP）率达0.999999999,三联体累计非父排除率（CPE）达0.999999997。结论新建立的23个STR复合扩增体系分型效果良好,在广东地区汉族人群中具有高度多态性,可满足日常法医鉴定的需要。     

亲子鉴定DNA分型亲权指数的简化计算法

PCR扩增DNA片段长度多态性位点，如AmP－FLP、PCR－STR分型技术，在亲子鉴定中应用日益增加。由于被选择应用的DNA位点均具高杂合度、高非父排除率，以及PCR技术取材广泛、灵敏度高等特点，PCR－DNA分型有。逐步取代常规血型检测的趋势。PCR－DNA分型结果表明，杂合子个体呈2条片段，纯合于及条片段，等位基因为共显性遗传，位点均具有不连续基因频率分布。所以，亲权指数计算并不复杂。本文依据单位点DNA分型特发，根据Esse。M6ller计算理论，提出一套简明亲权指数计算公式。同时对父子单亲亲子鉴定的亲权指数计算公式也作…     

微量DNA:容易忽略的生物物证

PCR技术的出现,大大提高了法医DNA分析技术的灵敏度,尤其是STR复合扩增技术的应用,不仅如同DNA指纹技术一样能够进行同一认定,而且使其灵敏度达到了纳克级以下的水平,大大提高了其解决微量、降解DNA的分析能力.Findlay等[1]成功地分析了低至单个细胞水平的模板DNA;Van Hoofstat等[2]利用DNA技术分析现场遗留指纹进行检验;Barbaro等[3]利用DNA技术对毛干进行检验;Schmerer等[4]和Burger等[5]分别用60和50个循环分析古代骨骼DNA;Van Oorschot和Jones[6]利用PCR检验,从电话话筒、钢笔、手提箱把手等提取的检材样品中得到DNA分型;Wickenheiser[7]从被盗汽车的方向盘上提取DNA进行STR分型,从而认定罪犯.以上研究报道的结果表明,现有的DNA技术能够对微量DNA进行检验.     

PCR技术的常见问题与处理方法

自1989年我国DNA指纹技术研究获得成功并正式用于法医物证检验以来,已经为侦查破案发挥了重要作用.随着DNA技术的深入发展,此后PCR技术由于它日益明显的优越性得到越来越广泛的应用.到目前为止全国已有几十个法医PCR实验室,从单个VN-TR和STR位点的扩增技术到银染检测,从复合扩增STR技术到荧光检测,使得该技术越来越精确和方便.笔者将在办案过程中就PCR技术的常见问题与处理方法,尤其是银染检测STR位点复合扩增技术和荧光检测STR位点复合扩增技术所积累的一些经验总结如下供大家参考.     

太原地区汉族Hum TH01位点基因频率分布调查

短串联重复序列（STR），是由几个碱基对作为核心单位，串联重复形成的一类DNA序列。由于其核心重复单位数目的变化构成了STR基因座的遗传多态性。在人类基因组中，平均每15kb就存有1个STR基因座，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源。1991年，Edwards［1］等人报告了从基因库中发现的10个“核心序列”为3～4hp的STR位点；1993年，国内刘健［2］等采用PCR技术成功地对HumTH01、HumFABP、HulnARA三个STR位点进行了复合扩增。笔者参考了以上文献报道的方法，根据本实验室的条件，用PCR技术电泳分离和银染色…