抗鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备抗鸭坦布苏病毒(DTMUV)囊膜(E)蛋白的单克隆抗体,将鸭坦布苏病毒E基因进行原核表达,目的蛋白被纯化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,按常规的单克隆抗体的制备技术,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA方法筛选及3次连续克隆化共获得6株能稳定分泌抗E蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,它们分别被命名为1F3、1G2、1B11、2A5、3B6和4F9。Dot-ELISA及Western-blot分析结果表明,这6株单克隆抗体均能与原核表达的E蛋白特异性结合。经间接免疫荧光(IFA)试验验证,这6株单克隆抗体均能识别鸭坦布苏病毒感染的细胞,且荧光主要位于细胞质中。结果表明,本研究成功制备了6株抗鸭坦布苏病毒E蛋白的单克隆抗体。鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备为今后鸭坦布苏病毒快速的病原学诊断以及E蛋白的结构和功能研究奠定了物质基础。     

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌延伸因子EF-Tu蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备鼠伤寒沙门菌延伸因子Tu(EF-Tu)的单克隆抗体,以原核表达并纯化的鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与SP2/0融合,以间接ELISA筛选出阳性克隆,经5次亚克隆后获得5株稳定分泌抗EF-Tu蛋白抗体的杂交瘤细胞株,遂将其命名为Tu1-A1、Tu1-C4、Tu1-H2、Tu4-C11、Tu9-B9。对这5株单克隆抗体的初步鉴定结果表明,其抗体亚型均为IgG1/κ型。以原核表达的带GST标签的EF-Tu蛋白做Western-blot检测制备的单克隆抗体,证实所制备的单克隆抗体具有良好的反应性。这些单克隆抗体的制备为后期研究EF-Tu蛋白在沙门菌侵入及胞内存活过程中的调控作用奠定了基础。     

牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定

为进一步研究牛IFN-γ(BoIFN-γ)单克隆抗体在牛免疫学以及牛疫病诊断中的应用,用原核表达的重组牛IFN-γ(rHis-BoIFN-γ)免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,免疫3次后取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经3～5次亚克隆,最终获得12株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株。Ig亚类鉴定结果显示这12株杂交瘤细胞均为IgG,其中5株为IgG1,3株为IgG2a,4株为IgG2b。这12株杂交瘤细胞在体外具有稳定分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的能力。Western-blot及间接ELISA证明这12株单克隆抗体均可特异性地结合rBoIFN-γ蛋白。间接免疫荧光试验显示,这12株单抗均与真核细胞BHK-21表达的rBoIFN-γ产生荧光反应,证明这些单抗能够与接近天然的BoIFN-γ反应,证实了单抗的特异性。ELISA叠加试验表明,3C2与1H4、1G6与1G4针对不同表位,1A10、1B2、2B9、3C4四株和1C1与1G6、1G4与3C2、1A10与1G8针对相同或相近的表位。     

猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA法对融合细胞进行筛选,采用有限稀释法对阳性细胞进行4次亚克隆,获得了3株能稳定分泌N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3.分别采用体外培养法、诱导腹水法和实体瘤法制备单克隆抗体,并用间接ELISA法检测其效价,结果显示,这3株杂交瘤细胞的细胞培养上清、小鼠腹水和血清的单抗效价均分别为1:512、1:10~5、1:10~5,其中以诱导腹水法制备的单抗产量和效价最佳.间接免疫荧光试验结果显示,这3株单抗均能与TGEV感染的ST细胞产生特异性免疫荧光,而不与猪细小病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒等发生交叉反应;经鉴定,3株单抗的亚类均为IgG2a,这3株杂交瘤细胞具有良好的遗传稳定性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ3毒株N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)BJ3毒株N蛋白及制备抗N蛋白单克隆抗体,将N基因克隆至原核表达载体pColdⅠ,利用大肠杆菌BL21表达出了N蛋白。将IPTG诱导的细菌反复冻融3次后超声裂解,离心后分别收集上清和沉淀,用镍柱亲和层析分别纯化,SDS-PAGE结果显示,N蛋白主要以包涵体的形式存在。用纯化的N蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,3次亚克隆后获取1株PRRSV N单抗,命名为F4。F4可与大肠杆菌BL21、不同PRRSV分离株表达的N蛋白发生特异性反应。本试验为进一步研究N蛋白的结构、功能及建立快速诊断PRRSV方法奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ3毒株N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）BJ3 毒株N蛋白及制备抗N蛋白单克隆抗体,将N基因克隆至原核表达载体pCold I,利用大肠杆菌BL21表达出了N蛋白。将IPTG诱导的细菌反复冻融3次后超声裂解,离心后分别收集上清和沉淀,用镍柱亲和层析分别纯化,SDS-PAGE结果显示,N蛋白主要以包涵体的形式存在。用纯化的N蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,3次亚克隆后获取1株PRRSV N单抗,命名为F4。F4可与大肠杆菌BL21、不同PRRSV分离株表达的N蛋白发生特异性反应。本试验为进一步研究N蛋白的结构、功能及建立快速诊断PRRSV方法奠定了基础。     

抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用已构建好的pET-30a重组菌E.coli Rosetta(DE3)表达鹅细小病毒(GPV)VP3重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后作为免疫原,经腹膜腔接种4～6周龄BALB/c小鼠3次,末次免疫后第3d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用建立的间接ELISA方法进行筛选,经4次亚克隆,最终获得4株能稳定分泌抗GPVVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、2A9、3B11和4A2。亚类鉴定结果显示,单抗1F1为IgG2b亚型,其余3株单抗为IgG1亚型,轻链均为κ链。经间接ELISA检测,单抗1F1、2A9、3B11和4A2的腹水效价分别为1:819200、1:1638400、1:409600和1:819200。Western-blot分析表明,获得的4株单克隆抗体均能特异性识别GPVVP3重组蛋白;间接免疫荧光试验证明,这4株单抗能够与天然GPV结合。     

鸭MAPK1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

为研制鸭丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)单克隆抗体,从樱桃谷鸭脾样品扩增鸭MAPK1基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建鸭MAPK1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白,经纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA筛选分泌抗鸭MAPK1的单克隆杂交瘤细胞株,进行3次亚克隆纯化后,制备小鼠腹水。采用间接ELISA测定腹水效价,用Western-blot检测其特异性,并进行单克隆抗体的亚类鉴定。测序结果表明,鸭MAPK1基因编码区全长1 107bp,编码369个氨基酸。SDS-PAGE检测结果表明,本研究获得了可溶性的42ku的鸭MAPK1重组蛋白。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,得到2株抗鸭MAPK1的阳性杂交瘤细胞株,腹水效价均达到1∶12 800以上,均为IgG1亚类。Western-blot分析结果表明,制备的单克隆抗体具有良好的免疫反应特异性。以上结果表明,本研究成功制备了抗鸭MAPK1的单克隆抗体,为进一步研究其在先天免疫反应中的作用奠定了基础。     

马立克病病毒Meq单克隆抗体的制备

为研制马立克病病毒RB1B超强毒株致瘤蛋白Meq单克隆抗体,本研究通过聚合酶链式反应(PCR)扩增马立克病病毒(Md5)meq基因5′端第1~507位核苷酸,将其克隆入原核表达载体p Cold-TF,转化到BL21(DE3)感受态中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。用融合蛋白His-Meq169腹腔免疫BALB/c小鼠,利用间接免疫荧光(IFA)和Western-blot检测多抗血清;血清检测阳性后,取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,利用IFA和有限稀释法筛选阳性单克隆杂交瘤细胞株,最后筛选出了4株阳性杂交瘤细胞株,即1C11、3E4、3G10和5H11。将获得的单抗经IFA方法检测强毒株Md5或弱毒株CVI988感染的CEF细胞,结果显示,Meq单抗可特异性识别MDV感染形成的细胞空斑。这为进一步研究Meq的生物学功能奠定了基础。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建

采用RT PCR技术从长白猪的肌肉组织中扩增出了泛素 (Ubiquitin)基因 ,并将其克隆到 pGEM Teasy载体 ,经测序表明 ,所克隆的基因与GenBank中已登录的序列同源性达 99%。利用设计的融合表达引物 ,分别将泛素基因与猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV )GP5蛋白成熟肽基因进行扩增 ,用重叠区扩增基因拼接法将 2个基因片段进行拼接 ,并插入真核表达载体 pcDNA4 .0HISMAXA中 ,构建出了 pcDNA U GP5重组质粒。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒(pCI-GP5和pcDNA-U-GP5)分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力,LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性,并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现,2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周,pCI-GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA-U-GP5质粒免疫组;而pcDNA-U-GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4-CD8 T细胞比例明显高于pCI-GP5组。表明,GP5基因可诱导产生较高的免疫反应,泛素与GP5的融合表达可增强PRRSV GP5诱导的细胞免疫反应。     

缺失信号肽和跨膜区的PRRSV GP5融合蛋白基因的表达

通过分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HH08株GP5基因序列,设计了2对引物,经PCR扩增,获得不含信号肽和跨膜功能区的GP5基因片段,长度分别为121 bp和248 bp。应用酶切位点相连构建融合基因技术,将2段基因亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组表达质粒pET-GP5。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得高效表达。免疫印迹试验证实,表达的融合蛋白能与特异性血清抗体反应,表明表达的PRRSV GP5蛋白具有良好的生物学活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白糖基化位点缺失突变株的构建

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增GP5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码GP5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pVR-N51A。在体外转录后转染BHK-21细胞,转染后第48小时收集细胞接种Marc-145细胞,进行突变病毒的拯救。然后通过RT-PCR扩增拯救病毒GP5蛋白的编码序列,序列分析显示构建正确。间接免疫荧光试验证明拯救病毒能够正常表达GP5蛋白。同时,中和试验结果初步表明GP5糖基化位点缺失影响PRRSV与中和抗体的反应。猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白不同糖基化位点缺失突变株的获得将为进一步揭示GP5蛋白糖基化与诱发机体免疫反应之间的关系奠定基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表达及其表达产物的抗原性

为了确定猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白A、B抗原表位之间的相互关系和对免疫的影响,应用PCR方法扩增出A、B抗原表位基因并分别克隆于原核和真核表达载体中。原核重组质粒表达的重组蛋白经Western-blotting检测证明,该重组蛋白具有良好的抗原性。将重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠,前者可诱导产生针对PRRSV的特异性ELISA抗体,但是此抗体没有中和活性;后者不能诱导免疫小鼠产生PRRSV特异性抗体。结果表明,中和抗体的产生不但与A、B表位的空间构象有很大的关系,如果蛋白质分子质量过小也不能诱导机体产生有效的免疫反应。     

2004-2010年浙江省及其周边地区PRRSV GP5基因的分子进化与变异分析

用RT-PCR方法对分离自浙江省及其周边地区部分猪场的50个猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株和3个疫苗毒株的GP5基因进行了扩增、克隆和序列分析,并与国内外的代表性毒株进行了序列比对。结果表明,2004-2010年检测的PRRSV毒株均属于美洲型,大部分毒株属于亚群1,各毒株间的核苷酸和氨基酸同源性分别在81.6%～100%和72.1%～99.5%之间,浙江省及其周边地区亚群1毒株与我国最早分离到的美洲型毒株CH-1a的核苷酸和氨基酸同源性分别为84.5%～95.7%和78.6%～95.0%,与疫苗株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为88.1%～99.2%和85.4%～99.0%。糖基化位点以及抗原表位都有一定程度上的变异。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建及其免疫效果

构建了泛素(ubiquitin,Ub)基因与密码子优化的PRRSV GP5蛋白(optiGP5)基因融合表达质粒pIR-Ub-optiGP5。间接免疫荧光和Western-blot分析表明,重组质粒转染293T细胞后能够瞬时表达。将pIR-optiGP5和pIR-Ub-optiGP5两种质粒DNA肌肉注射免疫BALB/c小鼠后,分别检测小鼠血清中抗GP5抗体、T淋巴细胞的增殖能力以及CTL活性。结果显示,pIR-optiGP5质粒免疫组在二免后可以检测到荧光抗体,而pIR-Ub-optiGP5质粒免疫组一直未检测到抗GP5抗体,但该免疫组的T淋巴细胞增殖指数及针对GP5的特异性CTL反应数值明显高于pIR-optiGP5质粒免疫组。这表明泛素与GP5的融合表达可增强细胞免疫反应。     

PRRSV GP3蛋白和PCV-2Cap蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的小鼠免疫试验

为了研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病双价基因工程亚单位疫苗,利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白和猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF3-ORF2,并对该重组病毒进行Western-blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验以及淋巴细胞增殖试验。结果显示,重组杆状病毒表达了重组GP3蛋白和Cap蛋白;该重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP3蛋白和Cap蛋白,并且重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠产生了抗PRRSV和抗PCV-2的特异性抗体,免疫小鼠血清中抗PRRSV和抗PCV-2的中和抗体效价分别达到1∶9.6和1∶13.6。淋巴细胞增殖试验表明,该重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答。结果表明,表面展示PRRSV GP3蛋白和PCV-2Cap蛋白的重组杆状病毒已构建成功,这为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和PCV-2的共感染奠定了基础。     

论东盟五国的国家竞争力

在全球化时代,各国的国际竞争力是参与经济全球化的前提条件和核心内容。本文借鉴和运用当代国际竞争力理论与评价体系,分析东盟五国国家竞争力的形成与发展,对影响各国国家竞争力的要素结构(国内经济实力、政府管理、基础设施、科技发展和国民素质等)进行剖析,探索全球化进程中东盟五国国家竞争力的基本特征和发展趋势。     

鸡传染性支气管炎病毒HN株5a 5b及N基因的遗传变异分析

从河南省某鸡场中疑似鸡传染性支气管炎(IB)的雏鸡病料中分离到1 株鸡传染性支气管炎病毒(IBV),暂命名为HN,鉴定为IBV。从接种HN毒株的鸡胚尿囊液中提取单股RNA后应用反转录聚合酶链反应(RT PCR)技术扩增得到包含IBV HN株5a、5b蛋白及N蛋白基因的约1 600 bp片段;将克隆测序的5a、5b及N基因分别与GenBank中11 株国内外参考毒株相应基因进行序列比较与遗传变异分析,发现IBV HN株变异独特,明显不同于国内外参考毒株。