猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典毒株的序列差异,分别设计了1对特异性鉴别引物和1条TaqMan探针,建立了检测PRRSV变异株的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,建立的方法可鉴别诊断PRRSV变异株和经典毒株,具有较高的特异性;可以检测相当于1TCID50的病毒模板,比常规RT-PCR方法的灵敏度高100倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<10%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对13份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出11份阳性,高于常规RT-PCR方法。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法能检测高致病性PRRSV变异株,不仅特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于变异PRRSV的临床诊断和流行病学调查。     

美洲型与欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型经典毒株、高致病性变异毒株以及欧洲型毒株基因组的序列差异,设计2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及欧洲型毒株的多重荧光定量RT-PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.999以上;特异性强,只有PRRSV出现阳性反应,而与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性高,经典毒株、变异毒株、欧洲型毒株的检出下限分别为1.13、1.37、1.39copies/μL,均比普通RT-PCR敏感100倍;重复性好,组内及组间变异系数均小于1.5%。应用所建立的方法对采集的282份临床病料进行检测,结果 PRRSV阳性101份,其中95份为变异毒株、6份为经典毒株、4份为变异毒株和经典毒株混合感染,未检测到欧洲型毒株。结果表明,本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可为PRRSV的快速鉴别诊断及流行病学调查提供有效的技术手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用微芯片荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立一种可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用的核酸检测技术,本研究根据已发表的多株PRRSV ORF6(M)基因保守序列,设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种可用于PRRSV通检的微芯片荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,与多种常见的猪病病毒均无交叉反应;通检性好,可以检出包括美洲型、欧洲型、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及NADC30-like等多种基因型PRRSV毒株;灵敏性好,检测下限为1×10~1TCID_(50)/mL,与常规荧光RT-PCR方法一致;重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于4%;且成本低,模板用量少,反应快速,全程仅需61 min;对80份临床样品的检测结果与常规荧光RT-PCR的符合率为100%。本研究建立的微芯片荧光定量RT-PCR技术为PRRSV的快速、通用型检测提供了有力的技术支撑。     

高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立

根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株.以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价.结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×109～3.15×100copies/uL具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.998;最低检测限为3.15 copies/uL.对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%.表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

河北省规模猪场猪生殖与呼吸综合征病毒的变异分析

为了解河北省规模猪场猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR方法对2004～2007年采集的12个典型发病场的病料样本进行了PRRSV Nsp2和ORF5基因扩增、克隆和测序,利用DNAStar和DNAMAN软件对所测序列进行了分析.结果显示,扩增的ORF5基因氨基酸序列同源性为98.7%～100%,与美洲型和欧洲型PRRSV参考株的同源性分别为88.9%～100%和62.9%～63.5%;扩增的Nsp2基因氨基酸序列同源性为82.8%～100%,与参考毒株的同源性为76.5%～100%;从2006~2007年的样本中扩增的6个PRRSV Nsp2基因均在第481位和533~561位共缺失30个氨基酸;系统进化树分析表明,这6个样本株均属于美洲型,分属于2个基因亚群,其中HB0503株与BJ4、NJ1、HN1、LP1和VR-2332遗传关系较近,其他株与JXA1、SX和BJ株遗传关系较近.结果表明,危害河北省规模猪场的PRRSV已经发生了较大的变异,其中2004～2005年的样本株属低致病性PRRSV毒株,而2006～2007年的样本株属高致病性PRRSV毒株.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Myanmar株全基因序列的测定与遗传变异分析

2010年首次从缅甸某发病猪场采集的疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and re-spiratory syndrome,PRRS)病料中分离到一株PRRSV,命名为PRRSV Myanmar株。应用RT-PCR方法分段扩增出Myanmar株的各基因片段,并将扩增产物分别连接到pEASY-T3载体并进行测序。序列测定结果表明,Myanmar株基因组全长15 411bp(不包括PolyA尾),包含10个开放阅读框,5′UTR长189nt,3′UTR长151nt。全基因序列与经典PRRSV VR2332株核苷酸序列的一致性为99.3%,与高致病性PRRSV NVDC-JXA1株核苷酸序列的一致性为89.5%。在非结构蛋白Nsp2区域并未出现特征性的30个氨基酸的缺失,而与欧洲型标准毒株(LV)核苷酸序列的一致性为54.6%。上述结果说明Myanmar株在基因型上属于经典美洲型。同时,遗传进化树分析显示,Myanmar株与PRRSV 01NP1.2株、RespMLV株、BJ-4株及PL97-1株的亲缘关系最近。     

两株分离自疫苗免疫猪场的PRRSV毒株的遗传演化分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重影响全球养猪业的传染病,疫苗免疫是防控该病的重要措施,但猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)容易发生变异从而降低了免疫预防的效果。本研究从免疫了高致病性PRRS疫苗的发病猪场,分离出2株PRRSV毒株,并测定了其全基因组序列,分别命名为:PRRSV/pig/CHN/JTS/201606和PRRSV/pig/CHN/TG/201711。为了探讨临床中分离得到的这2株PRRSV毒株与该场所使用疫苗之间的关系,我们进行了全基因序列的遗传变异和重组分析,结果显示,这2个毒株都以PRRSV-pig-CHN-TJ-200-610(EU860248.1)疫苗毒株为骨架,其中PRRSV/pig/CHN/JTS/201606毒株在ORF1a蛋白的1429-1522 aa区域存在独特的94 aa的缺失,PRRSV/pig/CHN/TG/201711毒株在1013-1132aa区域存在120 aa的缺失。综上,本研究结果表明,PRRSV疫苗株基因组中核苷酸的突变和缺失产生的新毒株是造成猪场疫苗免疫失败的原因。     

新的高致病性PRRSV毒株FZ16A的分子特征及其致病性的研究

为了掌握猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分离株的遗传变异特点,从福建省某疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场采集病料并分离病原,采用RT-PCR、间接免疫荧光试验及基因测序等方法将其鉴定为HP-PRRSV,命名为FZ16A株。对FZ16A株ORF5基因进行克隆和测序,并进行分子生物学研究。将分离毒株接种PRRSV抗原、抗体双阴性的60日龄仔猪,通过观察临床症状、病理解剖变化及其病理切片等指标初步探讨分离毒株的致病性。结果,FZ16A株是北美(NA)基因型高致病性PRRSV(HP-PRRSV)变异株。同源性分析显示,FZ16A株ORF5基因与北美株VR-2332核苷酸(氨基酸)序列的相似性为87.9%(85.1%),与JXA1的相似性为98.8%(97%),与欧洲典型菌株Lelystad病毒的相似性为63.3%(56.9%)。系统发育分析表明,FZ16A属于NA基因型,与其他高致病性PRRSV毒株具有相同的亚型。氨基酸序列分析表明,与VR-2332株相比,FZ16A在信号肽、跨膜区(TM)、初级中和表位(PNE)、非中性表位和N-糖基化位点方面有不同程度的变异。抗原性分析显示,FZ16A ORF5基因产物与JXA1具有相似的抗原性,抗原表位主要位于aa32-37,aa50-55,aa127-133,aa136-142,aa147-156,aa159-171,aa174-185和aa193-198区域。致病性分析表明,该分离毒株感染猪后能引起体温升高、咳嗽、食欲下降等临床症状,但并未引起试验动物死亡。剖检结果显示,FZ16A分离株能引起试验动物肺部组织实变,淋巴结肿大。肺脏病理切片可见FZ16A感染组动物有明显的间质增生性肺炎,肺泡壁毛细血管扩张充血,肺泡壁增厚等变化。以上结果表明,本研究分离的FZ16A株是新的变异毒株,丰富了该地区的PRRSV基因数据库,并为该地区PRRSV分子流行病学研究及防控奠定了一定基础。     

新的高致病性PRRSV毒株FZ16A的分子特征及其致病性的研究

为了掌握猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)分离株的遗传变异特点,从福建省某疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场采集病料并分离病原,采用RT-PCR、间接免疫荧光试验及基因测序等方法将其鉴定为HP-PRRSV,命名为FZ16A株。对FZ16A株ORF5基因进行克隆和测序,并进行分子生物学研究。将分离毒株接种PRRSV抗原、抗体双阴性的60日龄仔猪,通过观察临床症状、病理解剖变化及其病理切片等指标初步探讨分离毒株的致病性。结果,FZ16A株是北美(NA)基因型高致病性PRRSV(HP-PRRSV)变异株。同源性分析显示,FZ16A株ORF5基因与北美株VR-2332核苷酸(氨基酸)序列的相似性为87.9%(85.1%),与JXA1的相似性为98.8%(97%),与欧洲典型菌株Lelystad病毒的相似性为63.3%(56.9%)。系统发育分析表明,FZ16A属于NA基因型,与其他高致病性PRRSV毒株具有相同的亚型。氨基酸序列分析表明,与VR-2332株相比,FZ16A在信号肽、跨膜区(TM)、初级中和表位(PNE)、非中性表位和N-糖基化位点方面有不同程度的变异。抗原性分析显示,FZ16A ORF5基因产物与JXA1具有相似的抗原性,抗原表位主要位于aa32-37、aa50-55、aa127-133、 aa136-142、aa147-156、aa159-171、aa174-185和aa193-198区域。致病性分析表明,该分离毒株感染猪后能引起体温升高、咳嗽、食欲下降等临床症状,但并未引起试验动物死亡。剖检结果显示,FZ16A分离株能引起试验动物肺部组织实变,淋巴结肿大。肺脏病理切片可见FZ16A感染组动物有明显的间质增生性肺炎,肺泡壁毛细血管扩张充血,肺泡壁增厚等变化。以上结果表明,本研究分离的FZ16A株是新的变异毒株,丰富了该地区的PRRSV基因数据库,并为该地区PRRSV分子流行病学研究及防控奠定了一定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研究

采用差速离心和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北京地区分离株BJ-4病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规杂交瘤技术制备杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌PRRSV抗体的单克隆杂交瘤细胞株,命名为GE3.经过鉴定,GE3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类为IgG1;分子质量为161.64 ku;腹水效价为18×104;不与猪瘟病毒(HCV)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应;蛋白质印迹(Westren-blotting)试验结果表明,该株单克隆抗体为针对核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体;腹水与欧洲株(Lv)、美洲株(VR-2332)和北京分离株BJ-1、BJ-2、BJ-5、BJ-6均能发生反应,说明其所针对的位点为NP上的保守位点.     

同源重组技术在拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用

为探寻猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组的规律和机制,在反向遗传学技术平台基础上,设计了几对作为配体和供体的复制子质粒,相应配对后共转染Mar-c145细胞,经原代或传代培养后拯救出病毒,并对拯救病毒的序列进行了比对分析。结果显示,拯救的病毒为重组子,共含有供体和配体亲本部分序列;在配体和供体的同源序列区发生了分子间同源重组;重组区域存在着一定的随机性,分别依次在ORF1的256～318 nt区域、ORF5的13970～13992 nt、ORF6的14428～14494 nt及ORF7的15135～15161 nt区域发生了重组。本研究利用同源重组技术建立的重组体系,不仅揭示病毒重组区域具有随机性,而且也为其他RNA病毒的感染性cDNA克隆的构建提供了一种方法。     

猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的扩增与克隆

应用RT PCR方法扩增出猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的核衣壳蛋白基因 (N基因 ) ,并将其克隆到 pET 32a载体 ,构建了高效原核表达载体pETN。将 pETN重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌后 ,对插入片段进行了序列测定及同源性分析。结果表明 ,插入片段序列与PRRSV美洲型ATCCVR2 332株的ORF7核苷酸序列同源性达 99.9% ,与分离毒株的同源性达 99.0 %。     

猪生殖和呼吸系统综合征蜂胶疫苗和油乳剂疫苗注射部位的组织学变化比较

用猪生殖和呼吸系统综合征 (PRRS)蜂胶灭活疫苗和油乳剂疫苗给小白鼠腿肌注射免疫 ,分别于免疫后第 2、7、14和 3 5d剖杀 ,采取注射局部肌肉组织进行病理组织学观察。结果显示 ,蜂胶疫苗注射后即被吸收 ,局部不留痕迹 ,组织学变化轻微 ;油乳剂疫苗注射后在 3 5d试验期内一直未能全部吸收 ,局部呈炎性组织学变化。蜂胶灭活疫苗不但对局部的组织学影响明显小于油乳剂疫苗 ,而且可趋化大量吞噬细胞到注射局部 ,促进抗原的高效递呈 ,并且可在注射局部的吞噬细胞胞浆中停留 3 5d以上 ,可能起到了类似“抗原库”的作用 ,从而更加持久有效地诱导免疫应答     

斑点免疫金渗滤法检测猪生殖与呼吸综合征抗体的研究

应用提纯的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原包被硝酸纤维素膜,然后用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)建立了检测PRRS抗体水平的斑点免疫金渗滤法(DIGFA)。该法通过胶体金标记SPA直接显色,阳性者出现红色斑点,整个试验过程仅需5min即可判断结果;与猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病阳性血清不发生交叉反应;纯化PRRSV抗原的最低检测量为0.0553mg mL,即55.3ng 点。对200份猪血清用该法与ELISA同时进行PRRS抗体检测,两种方法的符合率达98%。     

PRRS抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以差速离心法结合蔗糖密度梯度离心法提纯的PRRSVSC2株作为包被抗原,建立了检测猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA法。该法的最适抗原包被浓度为5μg/mL,最佳酶标兔抗猪抗体稀释度为1∶5000,对猪抗PRRSV的IgG检测灵敏度达到0.1μg/mL。该法只与PRRS阳性猪血清呈现阳性反应,而与PRRS阴性猪血清和猪伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪瘟、猪细小病毒病阳性血清呈现阴性反应。应用该法检测PRRSVORF5基因疫苗免疫猪后的抗体消长规律表明,疫苗免疫猪后第7d抗体水平迅速上升,第75d达到高峰,然后缓慢下降,至第135d时仍然极显著(P<0.01)高于空载体对照和空白对照。试验结果表明,该法具有良好的特异性和敏感性,可用于PRRS流行病学调查和PRRSV基因疫苗免疫后抗体水平检测。     

截短的猪生殖与呼吸综合征病毒M基因的原核表达

根据GenBank上登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列,设计了1对引物用于扩增PRRSV M基因,经PCR、酶切及测序鉴定,成功构建了PRRSV M基因原核表达载体.重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting结果显示,出现一分子质量约为27.3ku的目的蛋白带,该表达蛋白可与PRRSV猪阳性血清发生特异性反应.表明,表达的蛋白具有良好的特异性.     

金丝桃素体外抗高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒活性的研究

为研究金丝桃素体外对高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性的影响,以Marc-145细胞培养增殖的PRRSV为研究对象,通过噻唑蓝(MTT)比色法和观察细胞病变效应(CPE),测定吸光度值(D490nm)和半数细胞感染量(TCID50),以细胞存活率、病毒抑制率和TCID50为指标,评价不同剂量的金丝桃素体外抑制PRRSV活性的效应,并通过改变加药方式(同时、感染前、感染后给药).探讨其抗PRRSV的作用机制.结果表明,在PRRSV感染的同时加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率略有升高,与PRRSV对照组和拉米夫定对照组相比,均有显著性差异(P<0.01).在PRRSV感染前和感染后加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率明显升高,且随药物浓度的增加而上升,与PRRSV对照组相比,有显著性差异(P<0.01),与拉米夫定对照组相比无统计学意义(P>0.05).金丝桃素可使PRRSV的TCID50从6.1下降至4.15.证实,金丝桃素具有多环节体外抗PRRSV效应;不同浓度的金丝桃素表现出不同的抗PRRSV活性,并呈现剂量依赖关系.     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒(pCI-GP5和pcDNA-U-GP5)分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力,LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性,并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现,2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周,pCI-GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA-U-GP5质粒免疫组;而pcDNA-U-GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4-CD8 T细胞比例明显高于pCI-GP5组。表明,GP5基因可诱导产生较高的免疫反应,泛素与GP5的融合表达可增强PRRSV GP5诱导的细胞免疫反应。     

三种猪繁殖障碍性病毒混合感染的分子生物学调查

根据GenBank登录的PRRSVORF7、PCV 2ORF1基因及PRVTK基因的核苷酸序列设计合成引物 ,建立了分别用于检测PRRSV、PRV及PCV 2的RT PCR及PCR方法。应用该方法对 77份可疑病料进行了检测 ,以调查猪群中PCV 2与PRRSV和 (或 )PRV混合感染情况。结果表明 ,2 4份样品表现为PRRSV与PCV 2混合感染 ,占样品总数的 31.2 % ;17份样品检测为PRRSV与PRV混合感染 ;9份样品表现为PCV 2与PRV混合感染 ,占 11.7% ;另外 ,还有一定比例的三重感染 ,共 8个样品 ,占 10 .4 %。结果显示 ,猪群中PRRSV、PRV与PCV 2的混合感染现象比较普遍     

用于诊断4种猪病毒病的寡核苷酸芯片的研制

制备可同时检测引起集约化养猪业常见4种传染病,病毒(猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳)的寡核苷酸芯片。根据4种猪疫病病毒特异性基因的保守区域设计合成了60 mer寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片。采用不对称PCR和间接荧光标记技术进行单链DNA扩增和荧光标记,标记样品与寡核苷酸芯片杂交后,进行芯片清洗、扫描及结果分析。杂交结果显示,4种病毒的寡核苷酸检测探针均特异地与相应的标记样品杂交,芯片上呈现较强的阳性杂交信号,而除阳性质控探针外,阴性对照和空白对照均检测不到荧光信号。证明寡核苷酸芯片适用于快速、准确、高通量地诊断影响集约化养猪业的多种猪疫病病毒。