H1N1亚型猪流感病毒HA基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的血凝素(HA)基因,测序后对HA基因进行了生物信息学分析。将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。诱导表达的HA融合蛋白分子质量约为94.0 ku,表达产物占菌体总蛋白的29.5%。经Western-blot分析证实可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。用纯化的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,成功筛选到2株针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体;ELISA结果表明,制备的SIV单克隆抗体ⅢF6A4C10与H1N1亚型SIV抗原具有特异的免疫反应性,为H1N1 SIV的鉴别诊断奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒vp3基因在昆虫细胞中的表达及其ELISA抗原反应性的分析

为分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组VP3蛋白的ELISA抗原反应性,将IBDVvp3基因插入杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-vp3并转化大肠杆菌DH10Bac感受态细菌,经抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBac-vp3。用pBac-vp3转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-vp3。对重组杆状病毒感染的Sf9细胞用Western-blot检测,在33ku处存在一条特异的蛋白条带;用间接免疫荧光试验检测时可见特异性荧光。以纯化的重组VP3蛋白为包被抗原建立了检测IBDV抗体的间接ELISA(VP3-ELISA),并与重组VP2蛋白包被抗原建立的VP2-ELISA和全病毒抗原ELISA(IDEXX-ELISA)进行了比较。对42份不同鸡血清中IBDV抗体的检测结果显示,VP3-ELISA的区分度低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA阳性检出率低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA与IDEXX-ELISA的相关系数低于VP2-ELISA与IDEXX-ELISA的相关系数。结果表明,在昆虫细胞中表达的重组VP3蛋白具有良好的特异性和抗原反应性,用它建立的ELISA的抗原反应性弱于用重组VP2蛋白和IBDV全病毒抗原建立的ELISA的抗原反应性。     

猪瘟病毒NS3蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

以含有猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA的重组质粒pOKShimen为模板,经PCR扩增获得NS3基因,利用原核表达载体pMAL-c2X、pET32a以及杆状病毒表达载体pFastBacH T B表达CSFV石门株NS3基因,获得3种重组蛋白:MBP-NS3、His-NS3和rNS3。Western-blot分析及间接免疫荧光试验证实,这3种不同载体表达的NS3蛋白均能被猪瘟阳性血清所识别。利用直链淀粉树脂柱对重组蛋白MBP-NS3进行纯化后,用其免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA筛选,获得2株能稳定传代并分泌针对抗CSFVNS3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为1D10和1H10。Western-blot分析及间接免疫荧光试验结果证明,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可识别CSFVNS3蛋白。     

禽流感病毒M2e多拷贝重组蛋白的原核表达及其免疫原性分析

为了获得流感病毒M2e多拷贝重组蛋白并分析其免疫原性,通过比对GenBank中H5和H9亚型流感病毒的M2基因,选择其N端由23个氨基酸组成的胞外域(M2e)序列进行合成,并将4个M2e序列与3个位于HA246~260T/B细胞表位交叉串联,在其末端添加酵母转录因子,然后克隆到pGEX-6P-1载体中,表达重组蛋白。SDS-PAGE和蛋白免疫印迹试验分析表明,重组蛋白成功表达,而后纯化获得高纯度产物。经纯化的重组蛋白与弗氏佐剂混合后肌肉注射BALB/c小鼠,二免2周后采集小鼠血清并用ELISA检测M2e抗体水平;同时分离脾细胞并用ELISPOT检测特异性T细胞的数量。ELISA结果表明重组蛋白能诱导免疫组小鼠产生高水平的M2e特异性抗体;ELISPOT分析显示,在M2e肽段的刺激下,免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞中的斑点形成数达150个。结果表明,成功表达的重组蛋白具有良好免疫原性,为广谱型流感病毒亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

口疮病毒VIR蛋白多克隆抗体的制备及VIR蛋白的亚细胞定位观察

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western-blot鉴定抗体的反应原性。利用脂质体介导法将pEGFP-VIR质粒转染绵羊睾丸细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后激光扫描共聚焦显微镜观察VIR在细胞内的表达和亚细胞定位。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GSTVIR蛋白,主要以可溶性形式存在,其分子质量约27ku,制备的多克隆抗体效价达1∶218;Western-blot分析结果显示,此多克隆抗体有较好的特异性反应;VIR蛋白主要定位于细胞核内。本试验结果为VIR生物学功能的深入研究奠定了基础。     

鸭MAPK1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

为研制鸭丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)单克隆抗体,从樱桃谷鸭脾样品扩增鸭MAPK1基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建鸭MAPK1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白,经纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA筛选分泌抗鸭MAPK1的单克隆杂交瘤细胞株,进行3次亚克隆纯化后,制备小鼠腹水。采用间接ELISA测定腹水效价,用Western-blot检测其特异性,并进行单克隆抗体的亚类鉴定。测序结果表明,鸭MAPK1基因编码区全长1 107bp,编码369个氨基酸。SDS-PAGE检测结果表明,本研究获得了可溶性的42ku的鸭MAPK1重组蛋白。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,得到2株抗鸭MAPK1的阳性杂交瘤细胞株,腹水效价均达到1∶12 800以上,均为IgG1亚类。Western-blot分析结果表明,制备的单克隆抗体具有良好的免疫反应特异性。以上结果表明,本研究成功制备了抗鸭MAPK1的单克隆抗体,为进一步研究其在先天免疫反应中的作用奠定了基础。     

牛轮状病毒VP7基因在昆虫细胞中的表达

利用PCR方法扩增出牛轮状病毒外衣壳蛋白VP7基因,经BamHⅠ+PstⅠ特异性酶切后,连接于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA中,成功构建了重组质粒pFastBacHTA-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素筛选和PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-VP7。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,成功扩增了VP7基因,大小为981bp,所表达的重组蛋白大小为40.4ku,与预期值相符,该蛋白能与牛轮状病毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛轮状病毒ELISA检测试剂盒奠定了物质基础。     

抗山羊IgMμ链单克隆抗体的制备及鉴定

将构建的山羊IgMμ链的原核表达重组质粒pET30a-IgMμ转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达获得重组蛋白His-IgMμ;以Ni-NTA亲和层析法纯化His-IgMμ重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、抗体筛选和细胞克隆等杂交瘤细胞技术,筛选能稳定分泌抗山羊IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用小鼠腹腔诱生腹水的方法制备出抗IgMμ链单抗,并鉴定单抗的生物学特性。结果,成功构建了重组表达载体pET30a-IgMμ,诱导表达、纯化得到了目的蛋白;获得了4株能稳定分泌抗山羊IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株,4株单抗腹水的效价均达到了1×10~(-4)以上,其中1D8、5D1和6G10株单抗亚型为IgG1,9H8株的亚型为IgG 2a,轻链均为κ;1D8、5D1、6G10和9H8的亲和力平衡解离常数KD分别为1.87×10~(-11)、8.46×10~(-7)、4.26×10~(-9)和4.07×10~(-10);经Western-blot鉴定,单克隆抗体6G10能特异性识别原核表达的HisIgMμ蛋白。上述研究结果表明,本研究获得了4株高亲和力和效价的抗山羊IgMμ链特异性单克隆抗体,这为山羊感染性疾病的早期诊断、预报预警和防控提供了基础条件。     

赤羽病病毒核衣壳蛋白原核表达及单克隆抗体制备

为制备赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳(N)蛋白单克隆抗体,本研究构建了pET-28aAKAV-N重组质粒,并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和镍柱纯化获得重组N蛋白。用重组N蛋白4次免疫小鼠后,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,利用亚克隆技术和ELISA方法筛选出4株阳性细胞株,分别命名为2D3、5F10、1F4和5D4,并对其进行特异性分析。免疫印迹(Western-blot)结果显示,2D3仅识别AKAV-N蛋白,5F10、1F4和5D4均能够同时识别AKAV-N和施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)N蛋白;间接免疫荧光(IFA)结果显示,2D3、1F4和5D4与AKAV感染的BHK21细胞呈阳性反应,而5F10为阴性。亚型检测结果显示,2D3抗体为IgG2a/к型,5F10、5D4抗体为IgG1/к型,1F4抗体为IgG1/λ型。综上所述,本研究获得的单克隆抗体能够为AKAV-N蛋白的相关研究提供支持。     

非洲猪瘟病毒PP62蛋白在昆虫细胞中的表达与鉴定

为表达非洲猪瘟病毒PP62蛋白,将非洲猪瘟病毒pp62基因克隆至pFastBac-HTA载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒rBac-pp62。将该重组病毒感染Sf9细胞后,采用间接免疫荧光(IFA)检测PP62蛋白的表达,通过亲和层析纯化重组蛋白PP62,以Western-blot和间接ELISA方法鉴定纯化的重组蛋白PP62的免疫反应活性。结果显示,重组杆状病毒rBac-pp62感染的Sf9细胞可以大量表达PP62蛋白,纯化的PP62重组蛋白能够与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应,以重组蛋白PP62为包被抗原建立的间接ELISA方法可以区分非洲猪瘟阳性血清和阴性血清。结果表明,表达的重组蛋白PP62具有良好的反应活性,可作为开发非洲猪瘟抗体检测试剂盒的抗原以及用于PP62蛋白的结构和生物学功能研究。     

杆状病毒GP64蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为研究杆状病毒GP64蛋白在感染宿主过程中的表达情况,通过克隆构建含GP64基因的重组质粒,在CHO-S细胞表达重组GP64蛋白,利用野生型杆状病毒免疫BALB/c小鼠血清,筛选出重组GP64蛋白的单克隆抗体。结果表明,构建出正确的GP64重组质粒,成功表达出GP64蛋白,筛选出1株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞5B1;单克隆抗体亚类鉴定结果显示,单抗亚类为Ig G2b,轻链类型为κappa;IFA和Western-blot结果显示筛选出的GP64单克隆抗体可以与杆状病毒及GP64蛋白发生特异性结合。结论,GP64蛋白的单克隆抗体制备成功。     

表达猫衣原体momp蛋白的重组狂犬病病毒SRV9-MOMP的构建与鉴定

为构建表达猫衣原体主要外膜蛋白(momp)的重组狂犬病病毒,以狂犬病病毒SRV9株反向遗传质粒p UC57-SRV9为骨架,在P/M基因间隔序列处插入MOMP基因,获得正确的重组全长转录质粒p UC57-SRV9-MOMP(P/M)。再将全基因组质粒与p UC57-N(SRV9)、p UC57-P(SRV9)、p UC57-G(SRV9)、p UC57-L(SRV9)4个辅助质粒共转染BSR-T7细胞系。经直接免疫荧光法验证,成功拯救出病毒SRV9-MOMP。Western-blot和RT-PCR检测表明,momp在重组病毒SRV9-MOMP感染的细胞内被稳定表达。本研究证明狂犬病病毒SRV9株具有作为载体表达外源蛋白的潜力,为研制高效、安全、经济的猫衣原体病疫苗奠定了基础。     

O型FMDV VP1基因的真核表达及其产物的生物学活性

根据已克隆的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计了1对带有SacⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用其将pMD18-T-VP1质粒中的VP1基因亚克隆到真核表达载体pBlueBacHis2A中,成功地构建了重组表达质粒pBlueBacHis2A-VP1(633bp)。将pBlueBacHis2A-VP1(633 bp)质粒与Bac-N-BlueTMDNA共转染sf9昆虫细胞,蚀斑筛选重组病毒后,将纯化的重组病毒感染sf9细胞,获得了32.6 ku的目的蛋白条带。Dot-ELISA分析结果表明,该表达产物具有反应活性,可用于建立间接ELISA方法,进行口蹄疫病毒抗体检测。     

ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP重组蛋白的表达及广谱性NDV单克隆抗体的制备

为了制备针对ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP蛋白的单克隆抗体,采用RT-PCR方法从ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株中扩增出NP基因,并定向克隆至pET-32a-c(+)原核表达载体中,经酶切鉴定及测序验证后转化BL21(DE3)进行原核表达,用纯化得到的NP重组蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠。结果显示,成功表达出分子质量约为71ku的NP重组融合蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的蛋白以可溶性形式存在于菌体中。用间接ELISA方法成功筛选出2株针对ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP蛋白的单克隆抗体,该抗体具有良好的ELISA、IFA以及Western-blot效价。免疫特异性鉴定结果表明,获得的2株单克隆抗体具有良好的通用性,无论是ClassⅠ毒株还是两种不同基因组长度的ClassⅡ毒株,均能与其发生特异反应。     

蓝舌病毒VP6蛋白的原核表达及抗体制备

本试验首先利用RT-PCR技术扩增获得了蓝舌病毒1型(BTV1)的VP6基因,然后将其克隆到表达载体pPRoEx-HTb上,构建重组表达质粒pPro-VP6,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后用IPTG诱导表达,优化表达条件,纯化重组表达的VP6蛋白,免疫新西兰白兔制备抗VP6蛋白的多克隆抗体,利用Western-blot和细胞免疫荧光试验检测抗体的特异性及VP6蛋白在BTV1感染细胞中的分布。结果显示,重组VP6蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,利用组氨酸标签纯化树脂获得了高纯度的VP6蛋白;制备的抗VP6多克隆抗体不仅可与重组表达的VP6蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然VP6蛋白发生特异性反应;在BTV1感染的BHK21细胞中检测到了VP6蛋白的特异表达,且分布于整个细胞质中。本研究成功表达了BTV重组VP6蛋白并制备了相应的特异抗体,为进一步揭示VP6蛋白的特性和功能奠定了基础。     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。     

结核分枝杆菌rv3295基因的原核表达及单克隆抗体的制备

以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增了rv3295基因;将其克隆至表达载体pET-22b中,构建了重组质粒pET-22b-Rv3295;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达出了Rv3295蛋白。通过亲和层析纯化,以该重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合筛选制备抗该重组蛋白的单克隆抗体;采用Western-blot验证单克隆抗体的特异性;通过亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型。结果显示,Rv3295蛋白以可溶形式表达,蛋白质的分子质量大小为25ku。获得1株抗该重组蛋白的单克隆抗体1F7,其亚型为IgG1/κ;Western-blot结果显示,该抗体具有较好的特异性。本研究制备的Rv3295蛋白的单克隆抗体对于研究Rv3295蛋白的功能及其与DNA之间的互作奠定了基础。     

H5亚型猪流感病毒HAl重组蛋白的制备及间接ELISA检测方法的建立

利用化学合成技术合成H5亚型猪流感病毒(SIV)的HA1基因,克隆到原核表达载体Pet-28a( ),构建了重组表达质粒pET28a-HA1/H5,用重组质粒转化表达菌株E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,以镍螯合层析纯化表达蛋白;通过优化反应条件,建立了基于HA1重组蛋白的H5亚型SIV抗体间接ELISA(iHAI-ELISA)检测方法.SDS-PAGE分析结果显示,在大肠杆菌中成功表达了分子质量为45ku的His-HA1融合蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在;Western-blot分析结果显示,表达蛋白能被抗His单克隆抗体和抗H5亚型SIV阳性血清特异识别.优化iHAI-ELISA中HA1/H5重组蛋白的包被浓度为0.31 μg/mL,待检血清的最佳稀释度为1:100.特异性测定结果显示,iHAI-ELISA方法不与H1、H3、H9亚型猪流感病毒抗体以及猪圆环病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒阳性血清发生交叉反应;iHAI-ELISA方法与血凝抑制试验的符合率达93.5%.表明利用重组HA1蛋白建立的检测H5亚型SIV抗体的ELISA方法具有良好的特异性和敏感性.     

H9N2亚型禽流感病毒M1基因的克隆及其原核表达

为克隆H9N2亚型禽流感病毒M1基因并研究其原核表达产物的反应原性,从H9N2亚型禽流感病毒中提取病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法克隆了M1全长基因。把M1基因克隆至pMD18-T载体中之后进行测序。M1基因亚克隆至pET-28a(+)表达载体中,构建重组表达质粒pET-28a-M1。该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导表达,对表达产物进行纯化和鉴定。测序分析结果表明,本研究克隆的M1基因与数株甲型流感病毒的M1基因的核苷酸同源性为89.7%~99.1%。SDS-PAGE分析表明,构建的重组蛋白以可溶性形式存在。Western-blot鉴定结果表明,它具有良好的反应原性。M1的成功表达为进一步研制新型流感疫苗奠定了基础。     

帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达。采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA、Western-blot与间接免疫荧光对多克隆抗体的效价与反应原性进行分析。结果显示,在37℃与0.1 mmol/L IPTG诱导条件下,PALVVP7重组蛋白在大肠杆菌中得以高效表达,其分子质量约为43 ku,以包涵体形式存在,占菌体蛋白总量的30.4%。重组蛋白经纯化与复性处理后纯度达94.1%,Western-blot结果显示,复性后的重组蛋白可与PALV阳性血清发生特异性结合。ELISA检测结果显示,制备的家兔抗PALVVP7多克隆抗体效价可达1∶12 000。使用该多克隆抗体为一抗,可通过免疫荧光与Western-blot检测到PALV感染细胞中的VP7蛋白,表明抗体可特异性结合PALV的VP7蛋白。本研究成功在大肠杆菌中表达PALV VP7重组蛋白,并制备获得多克隆抗体,为PALV诊断试剂的开发奠定了基础。