抗弓形虫单克隆抗体试剂的研究——分泌抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本研究选用了弓形虫QHO株活虫抗原免疫BALB/C小鼠,摘取脾细胞与SP_2/O骨髓瘤细胞融合,获得了分泌抗弓形虫McAb杂交瘤细胞株(2A_(11),3C_2)。其细胞分泌抗体效价为1:64(IHA),诱生腹水效价为1:1024和1:16384,经3个月连续培养和2次液氮冻存复苏培养,细胞生长良好,持续稳定分泌抗体效价不变,用诱生腹水经(NH_4)_2SO_4盐析、DEAE-Sephadex-A50层析和PEG浓缩,所得McAb致敏5％鞣酸化绵羊红细胞,与弓形虫可溶性抗原显示良好凝集效果,证明McAb与弓形虫可溶性抗原反应特异、敏感,并在血凝诊断试剂上具有应用价值。     

弓形虫DNA的提纯及其性质的研究

为建立提取弓形虫DNA的简便方法,我们于1989～1990年进行了本项研究。(一)材料和方法1.虫株:弓形虫(Toxoplasma gondii)ZA株,从浙江病猪体分离所得,由本所传代保存。2.弓形虫滋养体的纯化:取含滋养体的小鼠腹腔液,离心沉淀,经PBS洗涤2～3次后,加30～40倍体积的0.25％胰蛋白酶磷酸盐缓冲液,37℃水浴中消化20分钟;再用PBS离心洗涤4～5次,以除去胰蛋白酶液。最后在沉淀物中加少量PBS稀释,取少许涂片镜检纯化效果。3.弓形虫DNA的提取:将纯化的弓形虫滋养体悬液稀释至一定密度(OD值约为2.0)后,加入SDS使成2％终末浓度,混匀,置40℃水浴中作用1小时,充分裂解虫体。按Myers,W.T.等(1980)     

猫源弓形虫虫株的分离与鉴定

将猫的心、脑、舌用盐酸-胃蛋白酶溶液消化处理后接种小白鼠,经连续传代分离弓形虫虫株,用特异PCR方法对所分离的虫株进行了鉴定。分别从24只猫的样品中分离出8株弓形虫虫株,用弓形虫种特异的PCR方法对8个虫株进行鉴定,均得到弓形虫的特异条带;测序证明所扩增出的DNA片段确为弓形虫的核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS-1)部分序列。研究结果表明,将动物组织用盐酸-胃蛋白酶溶液消化处理后接种小白鼠是一种分离弓形虫虫株较为理想的方法,特异PCR方法能准确、快速地鉴定弓形虫虫株。     

弓形虫单克隆抗体试剂的研究——应用RIHA及IHA法对弓形虫感染兔、羊循环抗原和抗体的检测

应用抗弓形虫单克隆体(McAb)致敏绵羊红细胞建立的反向间接血凝诊断法(RIHA)和间接血凝诊断方法(IHA),对人工感染弓形虫的兔、羊血清进行了循环抗原(CAg)和抗体(Ab)检测。结果表明,弓形虫弱毒(QHO)株和强毒(RH)株感染的兔和羊血清,用RIHA检出CAg的时间在感染后1～2天,平均4天;IHA检出Ab的时间在感染后8～16天,平均12天。用毒力不同的弓形虫感染后,CAg检出时间有一定差异:QHO株感染的兔平均5.3天,羊平均6.25天;RH株感染的兔平均2.3天,羊为1天。兔、羊CAg的阳性检出率均为100％。兔、羊血清CAg于感染后23～66天先后消失,而Ab滴度长期维持在一定高度(1:64～1:4096)。证明RIHA方法对不同毒力弓形虫感染的动物血清CAg可以达到早期诊断的目的。为弓形虫病急性期和早期现症感染提供了可靠的诊断方法和手段。     

分泌抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立——体外免疫法制备免疫脾细胞

作者用纯化弓形虫速殖子可溶性抗原体外免疫BALB/C小鼠的正常脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ABC—ELISA和IHA筛选和3次克隆化培养后获得了1株分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞(E5)。E5杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经琼脂双扩散免疫试验确定为IgGl亚类抗体。单克隆抗体的抗原吸收试验结果证明E5单克隆抗体为抗弓形虫特异性抗体。E5杂交瘤细胞的染色体数目为92～108,经连续30代传递培养和4个月冻存复苏试验证明其分泌特异性单克隆抗体的性能相当稳定。初步证实E5单克隆抗体针对一种弓形虫的共同抗原成份。     

分泌抗弓形虫GJS株、NT株和RH株McAb杂交瘤细胞株的建立

自Khlor和Milstein 1975年创立淋巴细胞杂交瘤技术后,使在体外产生抗弓形虫特异性McAc及在此基础上分离、提取抗弓形虫保护性抗原和研制弓形虫基因工程苗成为可能,据此我们将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞分别与刚地弓形虫GJS珠、NT株和RH株可溶性抗原免疫BALB/C小鼠的脾细胞融合,经IHA检测和克隆化后,获得了4株杂交瘤细胞。该4株杂交瘤细胞所分泌的McAb经鉴定均属IeG_1亚类,4株杂交瘤细胞经连续60代传递和5～23个月冻存复苏     

“拔毛法”诊断猪囊虫病

在长期的活猪检验工作中,发现猪体被毛根部毛鞘颜色的变化与感染囊虫病有一定关系。为了探索出一种检出囊虫病猪的简便准确的诊断方法,而进行了“拔毛法”诊断猪囊虫病的试验。 (一)材料和方法 1.显色液:第一种为0.25％氢氧化钠溶液;第二种为三氯化铁溶液(2％液状FeCl_3或5％固状FeCl_3液)。 2.受检猪毛:从猪的肷部用钳口缠以胶布的钳子拔取数根毛,选择毛鞘完整的4～5     

弓形虫病免疫的研究——自然弱毒株(QHO)免疫原性的观察

本文描述了弓形虫自然弱毒株(QHO)速殖子不经任何理化处理,以敏感模式动物小白鼠进行的适宜免疫剂量、有效免疫力产生的时间、适宜攻击剂量和免疫持续期等项试验。结果用QHO株10~1～10~5免疫剂量存活率分别为100％、70％、100％、90％、80％;免疫后第14天即可产生免疫力,免疫后的小鼠可经受10~1～10~4以上强毒攻击,保护率达90％以上,免疫后小鼠经120天以上持续期观察和抗体消长规律测定都可经受10~5大剂量强毒攻击,保护率达90％,抗体滴度一直维持在高滴度水平(滤纸IHA法1:32)。证实QHO株是一种典型的弱毒株,并具有较好的免疫原性和激发机体产生明显的免疫保护效应,是许多弓形虫(RH、GJS、M-7741、GT-1等株)所不能相媲的一种特异弱毒虫株。为进一步研究弓形虫的生物学特性和弱毒株虫苗提供了依据。     

磺胺嘧啶对弓形虫在继代小鼠体内包囊形成的影响

用模式动物小白鼠继代弓形虫(Toxoplasmagondii)的过程中,随着继代次数增加,虫体毒力也随之增强,尤其弱毒虫株在继代过程中更为突出,随着继代次数和毒力的增强,鼠体内弓形虫包囊形成之前小鼠常发生死亡,从而给虫株包囊的研究带来一定的困难。据报道,国外研究者为获取弓形虫包囊,在继代小鼠的饮水中加入磺胺嘧啶(SD),可保证小鼠存活至组织包囊形成,但对饮服SD的浓度和时间未详细报道。为了确定不同浓度、不同饮服时间对小鼠体内弓形虫包囊形成及其毒力的影响,特进行了本试验。 (一)材料和方法 1.弓形虫QHO株组织包囊:弓形虫QHO株由本课题组分离继代培养。取预先接种弓形虫QHO株的小白鼠,引颈处死,取其含弓形虫包囊的脑组     

分泌抗细粒棘球蚴囊液抗原McAb杂交瘤细胞株的建立

用羊肝囊液纯化抗原免疫BALB/c鼠,取鼠脾细胞与SP2/o骨髓瘤细胞融合,经筛选及克隆化培养,获得3株分泌McAb的杂交瘤细胞株1D_3、3H_(11)和9E_(11)。3株McAb均属IgG_1亚类,能与人源和羊源的细粒棘球蚴囊液抗原反应,不与细颈囊尾蚴、肝片吸虫、脑包虫或弓形虫抗原反应。腹水中抗体的IHA最高效价可达2~(-13)。杂交瘤细胞经冻存、复苏和连续传代培养,分泌抗体性质稳定。     

华南地区黑冠松鼠猴(Saimiri vanzolinii)弓形虫虫株的分离鉴定

采用基于弓形虫虫株529 bp重复序列的PCR方法对采集的病料进行弓形虫分子鉴定。将该弓形虫阳性病料匀浆接种于BALB/c小鼠腹腔,经连续传代分离获得弓形虫速殖子。同时,根据弓形虫B1基因的PCR方法对该分离虫株进行鉴定,扩增出弓形虫B1基因特异条带。测序结果表明,此虫株扩增片段基因序列与GenBank中的弓形虫B1(AF179871)基因序列完全一致。通过PCR-RFLP分型鉴定,所分离的SS弓形虫虫株与传统Ⅰ型RH株、Ⅱ型PRU株和Ⅲ型VEG株的酶切谱系均有所不同,同时与Chinese#1型也有所不同,其被判定为国内另一种独特基因型弓形虫虫株,这为国内乃至华南地区弓形虫基因库的建立收集了样本,也为下一步野生动物弓形虫检测和防控提供了依据。     

绵羊体分离的一株弱毒弓形虫

随着我国人和动物弓形虫病研究工作的深入开展,已查知弓形虫血清抗体分布相当普遍,并从人和某些动物体分离出不同毒力的弓形虫株。1986年笔者从青海省互助县1只绵羊体分离出1株弓形虫,经鉴定为一弱毒株,命名为青海互助绵羊株(QHO)。     

细胞冻存时缓慢降温的简易方法

细胞冻存的妥当与否,会直接影响所冻存的细胞的活力,甚至关系到能否将细胞保留下来的问题。当前一般采用液氮冻存细胞,其基本原则是慢冻速融,特别是从0～-20℃间冷冻速度要缓慢,要控制好。我们国内目前还没有生产诸如CRY-MED型那种程序控制的冷冻器,一般采用经验的方法:冻存细胞的安瓿先放入冰箱,再放低温冰箱,再经液氮罐口氮气熏蒸,逐步下降至液氮内。此法虽然可用,只是操作烦琐,不易掌握好。在此,我们介绍一种简易而有效的缓慢降温的方法,便于细胞冻存。(一)方法与结果     

刚地弓形虫强弱毒株速殖子抑制消减cDNA文库的构建和初步分析

为筛选刚地弓形虫的毒力相关基因,以弓形虫为研究对象,构建了弓形虫强弱毒株抑制消减Cdna文库.分别收集弓形虫Ⅰ型RH株和Ⅱ型QHO株速殖子,提取总RNA,纯化后获得mRNA,并反转录为cDNA,用抑制消减杂交技术(SSH)构建弓形虫强弱毒株正向消减(弱毒株消减强毒株)及反向消减(强毒株消减弱毒株)cDNA文库.从两文库中各筛选10个阳性克隆测序及进行在线BIAST分析.结果显示,构建的弓形虫强弱毒株的消减cDNA文库具有较强的特异性;在获得的18个有效表达序列标签中,有12个与已报道的基因有较高相似性,另外6个可能代表新基因.表明,弓形虫强弱毒株差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究弓形虫毒力相关基因的功能奠定了基础.     

动物细胞的超低温长期保存效果观察

几年来我们应用-196℃的液氮超低温冻存技术,对牛睾丸、牛肾原代细胞,牛肾、猪睾丸、猪肾、狗肾、猫肾、地鼠肾、兔肾、非洲缘猴肾、小鼠纤维传代细胞等17种不同类型的细胞进行了长期冻存试验,并对其中8种细胞,进行了复苏培养观察,取得了满意的效果,细胞存活率达87％以上。     

克伦特罗单克隆抗体的制备与鉴定

将克伦特罗(Clenbuterol)重氮化后与牛血清白蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术获得1株稳定分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该单克隆抗体为IgG1亚类,用间接ELISA测定细胞上清液抗体效价为11.6×106,腹水抗体效价为13.2×108.抗体与沙丁胺醇无交叉反应.该细胞株体外传代培养和冻存复苏后仍能稳定分泌抗体.     

卡氏住白细胞虫子孢子冻存方法及感染力试验

用匀浆和离心的方法从阳性荒川库蠓体内分离出卡氏住白细胞虫子孢子 ,以直接冻存和间接冻存 2种方法分别对该子孢子进行保存 ;再分别以 3种剂量将不同方法冻存的子孢子和新鲜的子孢子分别给 3 2日龄的健康鸡接种。结果表明 ,经间接冻存的子孢子和新鲜的子孢子对鸡均具有感染力 ,而直接冻存的子孢子无感染力。     

人工感染弓形虫兔临床症状及血液学变化

(一)材料 1.弓形虫虫种:来源于兽大寄生虫病教研室。 2.试验动物:小白鼠,体重30～50g,用于虫种传代;日本大耳白兔33只,体重2～2.5kg,弓形虫病间接血凝反应阴性,体检健康。以上两种动物均由兽大动物室提供。 3.弓形虫病阳性、阴性血清、冻干抗原、稀释液:系兰州兽医研究所产品。 (二)方法 将试验兔分为接种组和对照组。 1.接种组:①动物感染:将弓形虫在小白鼠腹腔内增虫后抽出,用白细胞计数法计数后,按每毫升含100万个滋养体,每只兔腹腔接种1 ml,共接种23只。在接种前按每公斤体     

禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒VanRoekel(AEVVR)株通过SPF鸡胚传代复壮 ,获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒 114 3(AEV 114 3)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VP1基因序列 ,设计了 3对引物 ,分别扩增AEVVR株的VP0、VP3、VP1基因 ,将RT PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明 ,AEVVR株与AEV 114 3株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为 95 .1%、93.6 %和 93.9% ;氨基酸的同源性分别为 97.5 %、97.5 %和 99.6 %。     

莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚体内外抗弓形虫RH株速殖子的效果分析

通过弓形虫RH株速殖子在宿主体内和体外的感染试验,比较了莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚的抗弓形虫效果。体外试验:用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,评价了3种不同浓度的药物对人包皮成纤维细胞(HFF)毒性及增殖情况;在药物的安全浓度范围内,用5×10~4个弓形虫RH株速殖子感染5×10~5个HFF细胞,每种药物设置5个浓度梯度,培养48 h后观察药物体外抑制虫体在细胞内的增殖效果;以相对抑制率为指标,评估药物的体外抗弓形虫效果。体内试验:用5×10~4个弓形虫RH株速殖子接种小鼠,4 h后,3种药物分高中低剂量组进行灌胃给药,连续给药5 d后停药,观察并记录小鼠每天死亡情况;且每天每组随机抽取1只小鼠,检查腹腔液中速殖子量及停药后是否复发,评价药物体内抗弓形虫效果。体外试验结果表明:莫能菌素钠可显著抑制细胞内弓形虫的增殖,效果优于蒿甲醚,而磺胺嘧啶的效果波动性较大。体内试验结果表明:莫能菌素钠显著延长小鼠平均存活时间,磺胺嘧啶次之,蒿甲醚最次。体内和体外试验结果均显示出莫能菌素钠能显著抑制弓形虫速殖子增殖,延长小鼠存活时间。本研究为后续抗弓形虫药物研究以及临床用药提供了参考依据。