长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。     

几种蜱MLP基因的表达及其表达产物反应原性的分析

通过对饥饿的长角血蜱雌性成蜱cDNA表达文库中筛选到的未知基因进行5′RACE扩增,以期获得长角血蜱MLP基因全长cDNA序列。设计通用引物,采用PCR方法分别从青海血蜱、麻点璃眼蜱、森林革蜱、微小牛蜱及小亚璃眼蜱中对MLP基因完整的开放阅读框进行了扩增,并将其克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒,转入BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性。结果表明,成功扩增了长角血蜱的MLP基因全长序列及多个蜱种的MLP基因开放阅读框序列,体外高效诱导表达了约39.2ku的不同蜱的MLP重组蛋白。Western-blot结果表明,长角血蜱的MLP重组蛋白具有很强的反应原性,且不同蜱的重组蛋白间具有很强的交叉反应性。     

长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析

为构建长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库,获得长角血蜱雄性成蜱在半饱血状态下的特异表达基因,用抑制消减杂交方法构建以pGEM-T Easy为载体的长角血蜱半饱血雄蜱全蜱cDNA文库,测序并进行生物信息学分析.以新合成的长角血蜱饥饿和半饱血雄蜱cDNA第一链为模板,用RT-PCR方法对从文库中挑选的5个表达序列标签(EST)进行鉴定.初步获得18个EST,BlastX分析显示,所得cDNA编码的功能性蛋白主要包括信号传导、组织形态形成、转录调节和糖类代谢等相关蛋白.RT-PCR鉴定结果显示,随机挑选的5个新EST中有3个在半饱血状态下差异表达.结果表明,成功地构建了长角血蜱雄性全蜱抑制消减杂交文库,获得了有潜在生物学功能的EST.     

长角血蜱MLC基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析

为了解长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)肌球蛋白碱轻链(MLC)基因表达产物的免疫学活性,利用RT-PCR方法扩增了长角血蜱MLC基因的完整开放阅读框,将该基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中进行表达,在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导条件下,用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,该重组蛋白的表达分子质量为44ku。Western-blotting结果显示,MLC蛋白能被兔抗长角血蜱成蜱阳性血清识别,表明MLC蛋白具有良好的反应原性。     

长角血蜱Ykt6蛋白抗东方泰勒虫感染的生物学效应

为了解Ykt6基因在蜱体中影响东方泰勒虫感染的生物学效果,通过长角血蜱实验室培养株和野外株,评估Ykt6蛋白对东方泰勒虫侵染长角血蜱过程中蜱的存活率、繁殖率以及对东方泰勒虫感染率等指标的生物学效果。结果显示,Ykt6基因参与了东方泰勒虫与长角血蜱之间的宿主-寄生虫相互作用。Ykt6基因的表达水平与东方泰勒虫在长角血蜱体内的存活和繁殖能力密切相关,当该基因表达水平降低时,东方泰勒虫的存活率和繁殖能力显著下降。进一步的研究发现,Ykt6基因的变异可能影响东方泰勒虫与长角血蜱之间的相互作用。一些野外长角血蜱个体具有Ykt6基因的突变,导致东方泰勒虫在长角血蜱体内的存活和繁殖能力显著下降。这一发现提示,Ykt6基因的变异可能是东方泰勒虫入侵长角血蜱的一个关键因素。总之,Ykt6基因对东方泰勒虫入侵长角血蜱具有重要影响。通过研究Ykt6基因的功能和变异,可以深入了解东方泰勒虫与长角血蜱之间的相互作用,为控制东方泰勒虫入侵提供新的思路和方法。这将有助于保护人畜健康和生态环境的平衡。     

miR-275在长角血蜱不同发育阶段及组织中表达的动态变化

根据本实验室建立的高通量测序数据库中长角血蜱miR-275的成熟体序列信息,设计出特异性茎环引物及PCR扩增引物,同时以长角血蜱β-actin基因(GenBank登录号:AY254898)为内参基因,绘制标准曲线,计算长角血蜱miR-275的标准拷贝数,采用GraphPad Prism 5软件分析miR-275在长角血蜱不同发育时期及不同组织中的表达情况。结果显示,长角血蜱miR-275和β-actin标准曲线的回归系数均大于0.99,熔解曲线峰值单一,Ct值的变异率均小于5%,表明引物特异性好,标准曲线重复性和稳定性高。用real-time PCR方法对miR-275在长角血蜱卵的不同发育时期、蜱不同发育阶段及不同组织中的表达情况进行分析。结果显示,miR-275在长角血蜱卵发育到第16天的拷贝数最大,为(13.07±1.63)×106 copies/μL,是表达量最低的第5天的43.57倍;在饱血成蜱中拷贝数最多,为(18.95±1.55)×106 copies/μL,是饥饿成蜱的236.88倍;长角血蜱卵巢中拷贝数是最高的,为(15.29±3.59)×106 copies/μL,是表皮表达量的10.47倍。结果表明,miR-275在长角血蜱卵的发育、细胞增殖、组织分化等过程中可能起到了至关重要的作用。     

长角血蜱酸性磷酸酶全长cDNA的克隆与原核表达及其表达产物的酶活性分析

通过对长角血蜱饥饿雌性成蜱cDNA表达文库中筛选到的未知基因进行5′RACE扩增,得到了长角血蜱酸性磷酸酶全长cDNA序列。利用生物信息学方法对该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了分析,同时构建了系统发育树。采用PCR方法扩增目的基因完整的开放阅读框,将其克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒,转入BL21(DE3)中,经IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Wes-tern-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性,同时进行体外酶活性分析。结果表明,成功获得了长角血蜱酸性磷酸酶全长序列,体外高效诱导表达了约67.0 ku的重组蛋白。Western-blot表明该蛋白具有很强的反应原性,且在pH5.0时,该酶水解对硝基苯磷酸二钠的能力最强。     

长角血蜱三种miRNAs在不同发育阶段和器官中的表达分析

为了研究长角血蜱体内miRNAs的生物学功能,本研究从饱血后差异表达的miRNAs中筛选了3种miRNAs(mi R-278,Let-7和Bantam),采用荧光定量PCR方法检测了3种miRNAs在蜱的各个发育阶段和成蜱四种不同器官中的表达量;经miRNAs化学拮抗剂的注射,进行相应miRNAs的干扰试验。结果显示,在蜱体内获得了miRNA-278,Let-7和Bantam的前体序列,三种miRNAs的表达量在饱血后存在差异,在若蜱和成蜱的脂肪体中表达量最高,但Bantam表达量在各个阶段均较miR-278和Let-7低。结果表明,3种miRNAs的表达具有阶段和器官特异性,miR-278对长角血蜱成蜱的上体率和致死率影响显著。本研究可为抗蜱新药或疫苗的研发提供新的途径。     

实验室条件下长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生物学特性

在实验室条件下,对我国北方长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生活史进行了首次观察。研究发现,行孤雌生殖的长角血蜱为三宿主蜱;在兔体完成1个世代共需106~154 d,饥饿期的幼蜱、若蜱与两性生殖的饥饿幼蜱、若蜱体重的差异不显著(P>0.05),而饱血体重与两性生殖的长角血蜱种群饱血体重差异极显著(P<0.01);雌蜱饱血体重可达吸血前的108.46±19.72倍,与两性生殖的种群饱血体重差异亦极显著(P<0.01)。雌蜱产卵量与饱食体重之间呈极显著正相关r=0.897 0(P<0.01);生殖效率指数REI=6.76,生殖适合度指数RFI=6.29;蜱发育时间在不同季节无明显变化。     

牛大巴贝西虫在我国的发现及其媒介蜱的确定

首次在我国发现和分离出一株牛的大巴贝西虫并确定了其媒介蜱为长角血蜱。1988年4月,从河南省卢氏县同一群黄牛体上采集到长角血蜱饱血雌虫4只和微小牛蜱饱血雌虫16只,然后分别用其第二代幼虫、若虫和成虫感染除脾小牛。结果证明长角血蜱饱血雌虫能经卵传递大巴贝西虫,第二代幼虫对牛具有感染力,若虫和成虫不能感染。微小牛蜱的幼虫、若虫和成虫各期都不能传播这种巴贝西 虫。长角血蜱幼虫感染的小牛,红细胞内的虫体稍小于双芽巴贝西虫,大于牛巴贝西虫,双梨子形虫体较宽,其量度为3.1～3.7×1.5～2.3μm,长宽指数为1.87。     

利用转基因植物生产口蹄疫可饲疫苗的研究进展与前景

从口蹄疫可饲疫苗的研究概况、生产技术要点、优缺点及需要改进的问题几方面阐述了利用植物反应器生产口蹄疫可饲疫苗的研究前景。综述了口蹄疫可饲疫苗的研究进展,介绍了利用植物反应器生产口蹄疫可饲疫苗的技术要点,包括在口蹄疫病毒遗传转化质粒载体系统中最常用的农杆菌介导法,提出了生产口蹄疫可饲疫苗需要改进的技术问题。     

马鼻肺炎疫苗的研究现状及前景分析

介绍了3类马鼻肺炎疫苗的制备工艺、自身特点,分析比较了各类型疫苗的优缺点,并对其商品化进行了可行性分析,指出传统疫苗(灭活疫苗、减毒疫苗)是目前传染病防治的主要产品。虽然新型疫苗(病毒活载体疫苗)还处在研究阶段,但终将成为马鼻肺炎疫苗未来发展的主要方向。     

家畜重要支原体病疫苗的研究进展

综述了山羊传染性胸膜肺炎、传染性无乳症、猪支原体肺炎、牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病等几种重要的家畜支原体疾病疫苗的优点、缺点、研究进展以及应用情况,展望了利用基因工程技术开发有关新型疫苗的前景,旨在为研制新型家畜支原体疾病疫苗、减少其对家畜养殖带来的损失提供思路。     

禽流感基因重组活载体疫苗和表位疫苗的研究进展

为了解禽流感新型疫苗的研究现状,从载体选择和候选基因等方面论述了基因重组活载体疫苗和表位疫苗的研究进展,并对这两种疫苗的发展前景进行了展望,以期为禽流感新型疫苗的研究提供参考。     

产肠毒素性大肠埃希氏菌基因工程疫苗的研究进展

简述了产肠毒性大肠埃希氏菌(ETEC)K88-K99、K88ac-LTB、K99-F41和ST-LT双价基因工程疫苗的研制方法、生产工艺、免疫效果及生态效应及其研究进展,同时阐明了用这些疫苗免疫妊娠母畜,可使吸吮了母畜初乳的幼畜的腹泻发病率和死亡率显著下降,且不会带来生态环境污染。认为这些基因工程疫苗仍有不足之处,需要进一步加以改进。     

重组鸡白细胞介素6对不同种类疫苗的免疫增强作用

为评价重组鸡白细胞介素6(rChIL-6)在商品鸡体内对不同种类疫苗的免疫增强作用,采用不同接种方式,应用rChIL-6分别对不同种类新城疫病毒(NDV)单联疫苗和新城疫病毒-传染性支气管炎病毒-禽流感病毒H9亚型三联疫苗(NDV-IBV-H9)进行了免疫增强试验以及传染性法氏囊病病毒(IBDV)单联油乳剂灭活疫苗的免疫增强田间试验,并进行了将rChIL-6与NDV Ⅳ系预混合乳化制备成的灭活疫苗的免疫试验.结果表明,将rChIL-6与NDVⅣ系、Ⅰ系活疫苗预混合后分别采用滴鼻点眼、肌肉注射接种方式的免疫增强效果优于其他方式;rChIL-6与NDV抗原预混后制备成油乳剂灭活疫苗的免疫增强效果优于将相同抗原量的NDV油乳剂灭活疫苗和rChIL-6同时分点免疫接种.rChIL-6对NDV油乳剂灭活疫苗的免疫增强效果优于活疫苗,对NDV单联灭活疫苗的免疫增强效果优于NDV-IBV-H9三联灭活疫苗.田间试验表明,rChIL-6对IBDV油乳剂灭活疫苗首免和二免都具有显著的免疫增强作用,二免的免疫增强效果优于首免.这些研究结果为进一步开展新型鸡基因工程免疫增强剂研究奠定了基础.     

推进中日旅游发展对策研究

以地域“共生”角度来看待中日旅游发展的战略步骤,在现阶段,期望更多的日本游客来华是缺乏新意的。应从推进和发展中日旅游的步骤可以分为资源的整治与互知、旅游人脉网络的建设、切入技术研究等三个层面对促进中日旅游有个全新的考虑。     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果分析

为探讨禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果,利用PCR技术扩增了禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因片段,并克隆入pcDNA3.1(+),构建了DNA疫苗pcDNA-OMPH(pOMPH)、pcDNA-OMPA(pOMPA)和pcDNA-OMPH/OMPA(pOMPHA),将其体外转染SP2/0细胞,用间接免疫荧光试验检测其表达情况。同时以弱毒活疫苗作为阳性对照,pcDNA3.1(+)和PBS作为阴性对照,分别免疫4周龄鸡,检测血清特异性抗体水平、外周血淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况,经强毒攻击后计算各疫苗的保护率。结果显示,融合DNA疫苗组血清抗体水平与弱毒活疫苗相当,明显高于单价DNA疫苗(P<0.05);pOMPHA组的刺激值(SI值)和IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05),单价DNA疫苗组略高于弱毒活疫苗组;强毒攻击后各DNA疫苗均可为动物提供一定的保护力,其中融合DNA疫苗的保护率最高,可达86.7%,其次为弱毒活疫苗,为73.3%,而单价DNA疫苗则低于弱毒活疫苗,仅为60%和66.7%。结果表明,DNA疫苗尤其是融合DNA疫苗在预防禽多杀性巴氏杆菌病(禽霍乱)方面具有较好的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究进展

简要介绍了国内外猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗的研究进展,分析了猪繁殖与呼吸综合征疫苗研制中存在的问题和未来发展趋势,以便兽医药科技工作者全面了解猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研发及使用现状,进而指导临床应用.     

双顺反子表达质粒在DNA疫苗研究中的应用

简述了DNA疫苗的研究概况,介绍了真核双表达质粒的结构特点及其在基因佐剂和二价DNA疫苗中的应用情况,总结分析了双表达质粒的优点和存在的问题,并对其今后在DNA疫苗中的研究方向和前景进行了展望。