猪轮状病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的猪轮状病毒VP6蛋白作为检测抗原,建立检测猪轮状病毒血清抗体的间接ELISA。优化后的反应条件为:抗原包被量为6μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的工作浓度为1∶5 000。应用该方法检测阴性血清样本30份,确定的检测临界值为0.143(D490nm≥0.143,则判定为阳性)。特异性试验表明,用建立的间接ELISA对传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒和伪狂犬病病毒阳性血清进行检测时无交叉反应。重复性试验证实,批内和批间变异系数均小于10%。结果表明,本研究建立的用以检测猪轮状病毒抗体的间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可应用于猪轮状病毒的病原学检测。     

基于非洲猪瘟病毒p72蛋白的阻断ELISA检测方法的建立及初步应用

本研究以真核表达的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白为包被抗原,以抗ASFV p72蛋白的特异性单克隆抗体为检测抗体,经条件优化,建立了特异性检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。结果显示,最佳抗原包被量为100 ng/孔,待检血清样本最佳稀释度为1∶2,酶标抗体最佳稀释度为1∶10 000。该阻断ELISA方法的结果判定标准:当血清样品的PI≥41.84%时,判定为阳性;当血清样品的PI41.84%时,判定为阴性。特异性试验结果显示,该方法仅能与非洲猪瘟病毒阳性血清反应,与PRV、PCV2、PRRSV、CSFV和PPV等猪病疫苗毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒的对比检测结果表明,两种方法的符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法可以应用于ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及疫情监测提供了有效的检测手段。     

基于PLD蛋白的伪结核棒状杆菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立以PLD蛋白为包被抗原的伪结核棒状杆菌(C orynebacterium pseudotuberculosis,C p)血清抗体间接ELISA检测方法,以原核表达得到的重组PLD蛋白作为包被抗原,并进行特异性、敏感性和重复性试验,以及对临床样本进行检测。结果显示,重组PLD蛋白大小为33 ku,Western-blot检测具有良好反应原性;建立的间接ELISA检测方法最佳抗原包被量为每孔200 ng,血清以1∶200稀释作用1 h,酶标二抗以1∶5 000稀释作用1 h,TMB显色20 min,血清阴阳性临界值为0.367。特异性试验表明,建立的ELISA方法对羊布鲁菌、产气荚膜梭菌、羊结核、羊衣原体和小反刍兽疫阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;灵敏性试验表明,当C p标准阳性血清1∶1 280稀释时检测结果仍为阳性,灵敏性良好;重复性试验表明,批内和批间变异系数分别在2.27%～8.89%和2.11%～6.92%,重复性良好。对临床采集的山羊样本进行检测与实际患病情况的符合率为96%,符合率较高。对陕西省不同羊场的643份山羊血清进行检测,C p阳性率为31%。本研究建立的C p抗体检测方法为下一步研制C p抗体ELISA检测试剂盒提供了理论基础。     

应用旋毛虫GAD和GLS重组抗原建立间接ELISA方法的研究

为了建立快速检测猪旋毛虫病的血清学方法,分别用旋毛虫GAD、GLS重组蛋白作为包被抗原,建立2种检测旋毛虫血清抗体的间接ELISA方法。对抗原包被条件、血清稀释度、封闭液的选择与封闭时间、酶标二抗的稀释度与孵育时间和TM B作用时间等条件进行了优化。旋毛虫GAD包被抗原间接ELISA方法和GLS包被抗原间接ELISA方法的阴阳性临界值分别为0.848和0.963;这2种间接ELISA方法批内和批间重复试验的最大变异系数均小于10%,且用这2种方法分别对猪蛔虫阳性血清、华支睾吸虫阳性血清和弓形虫阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明这2种方法具有很好的稳定性和特异性。同时用这2种间接ELISA方法和旋毛虫抗体快速检测卡分别对感染旋毛虫不同数量、不同时间的小鼠血清进行检测,结果显示,这2种间接ELISA方法具有较高的敏感性。本研究中建立的这2种间接ELISA方法为旋毛虫病的早期诊断和流行病学调查提供了必要的手段。     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应30 min,底物在37℃显色15 min,D655 nm阴性、阳性临界值为0.5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验,表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测,结果显示,阳性血清的符合率为27.8%,阴性血清的符合率为91.7%。     

基于重组IBDV VP3蛋白的免疫磁珠间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

本研究旨在毕赤酵母中表达鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的VP3蛋白,以重组VP3蛋白作为包被抗原建立IBDV血清抗体免疫磁珠间接ELISA检测方法并进行初步应用。利用毕赤酵母表达系统获得约为39 ku的重组VP3蛋白,Western-blotting检测表明,重组VP3蛋白具有良好的特异性和反应原性。免疫磁珠间接ELISA的最佳反应条件:磁珠和抗原偶联的缓冲液是50 mmol/L MES(p H 8.0),偶联时间为3 h,抗原加入量为95μg,抗原与羧基磁珠最大偶联量为80μg。待检血清和酶标二抗的稀释度分别为1∶1 600和1∶4 000,血清孵育时间为30 min,酶标二抗孵育时间为20 min。在该优化条件下,阴性、阳性临界值判定标准为0.134。特异性试验显示,对抗AIV、IBV、MDV、NDV阳性血清检测结果均为阴性。敏感性试验显示,本试验所建立的检测方法敏感性高于商品化IBDV血清抗体检测试剂盒。重复性试验显示,批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.8%和5.9%。稳定性试验结果显示变异系数小于7%。用建立的检测方法和商品化IBDV血清抗体检测试剂盒同时检测50份血清,结果显示两种检测方法的相对敏感性为94.6%,相对特异性为92.3%,符合率为94.0%。本试验建立的检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、稳定性高特点,为其应用于临床IBDV血清抗体的检测奠定了基础。     

猪瘟病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速、准确的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,根据Gen Bank上猪瘟兔化弱毒全基因序列,设计1对引物,扩增E2蛋白主要抗原区基因片段;然后,将其克隆入载体p ET-28a(+),采用大肠杆菌Rosetta(DE3)表达出含E2蛋白主要抗原区的重组蛋白。以纯化的截短E2蛋白为包被抗原,优化间接ELISA反应条件,建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA。经过优化,确定最佳抗原包被浓度为8 g/m L,待检血清稀释倍数为1∶160,酶标二抗稀释倍数为1∶2000。该方法的阳性临界值为0.37,阴性临界值为0.32。批内变异系数在1.58%~3.33%之间,批间变异系数在2.67%~5.35%之间,说明该方法重复性良好。特异性检验中,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒、传染性胃肠炎病毒、乙型脑炎病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒阳性血清均没有交叉反应。用该方法与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒对1 101份临床猪血清样品进行符合性检测,结果,该方法的敏感性、特异性、符合率分别为89.07%(603/677)、77.59%(329/424)和84.65%(932/1101)。上述结果表明,该方法可用于临床CSFV血清抗体的检测,为CSFV血清抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

抗鹅细小病毒卵黄IgG的制备及其间接ELISA检测方法的建立

采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提与DEAE50纤维素层析相结合的方法从免疫鹅细小病毒(GPV)的鹅卵内提取鹅卵黄IgG,通过核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG的浓度和纯度后,制备兔抗鹅IgG酶标抗体;建立了针对GPV的间接ELISA抗体检测方法,确定其最佳工作条件,并对该ELISA的特异性及重复性进行检测;应用该间接ELISA检测了GPV VP3基因疫苗的免疫效果。结果显示,获得的纯化鹅卵黄IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度达到94.5%,兔抗鹅IgG的血清琼脂扩散效价约为1∶32;经筛选确定该ELISA的最佳工作条件为:最适抗原包被浓度为20μg/mL,最适血清稀释度为1∶100,酶标抗体的最佳工作浓度为1∶3 000。用建立的间接ELISA检测禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒的阳性血清均为阴性,表明该方法特异性强、重复性好。经临床初步应用,能检出GPV VP3基因疫苗产生的抗体,在肌肉注射100μg与200μg基因疫苗的鹅血清中,IgG均从第14天开始上升,并分别在第35、21天达到最大值。表明本试验制备的兔抗鹅IgG酶标抗体具有较好的应用价值。     

猪轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用差速离心法纯化的猪轮状病毒(RV)分别免疫仔猪和兔,制备了猪抗RV和兔抗RV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测RV的双抗体夹心ELISA方法.结果表明,该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:猪抗RV IgG包被浓度为4 μg/mL,兔抗RV IgG最佳工作浓度为3.5μg/mL,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:8 000,以D<,450nm≥10.161作为阳性判定标准.该ELISA的重复性变异系数小于10 %,最低检测限为1.25μg/mL,并与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温和4℃条件下至少可保存4个月.用该ELISA方法和RV金标检测卡检测70份临床粪便样品,结果显示,ELISA的阳性检出率为22.9%,而金标检测卡的阳性检出率为20.0%.表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于RV的快速检测.     

产肠毒素大肠杆菌F41菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的重组F41茸毛蛋白作为检测抗原,建立了检测产肠毒素大肠杆菌F41菌毛抗体的间接ELISA方法.经优化筛选的最佳反应条件:包被抗原浓度为0.26μg/孔,血清稀释度为1:800.酶标二抗工作浓度为1:6 000,30 g/L明胶封闭1 h,底物作用时间为10 min.经试验验证,该方法具有特异性好、敏感性高、重复性好、稳定性强等特点.用建立的间接ELISA方法与PCR方法进行符合性试验,总符合率为97.4%.表明,该方法可以用于产肠毒素大肠杆菌F41菌毛抗体的检测.     

猪血清中牛病毒性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

为建立检测猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的ELISA方法,经ELISA反应条件优化、特异性试验、重复性试验及与中和法、IDEXX ELISA对比试验建立了特异性ELISA。用此方法对福州市周边20个猪场的222份猪血样进行了BVDV抗体检测。结果显示,本ELISA反应条件为:BVDV Oregon C24V与NADL株联合包被(质量浓度均为31.25μg/L,每孔加50μL)的条件为37℃1h加4℃8h,家兔抗猪瘟病毒(CSFV)超免疫血清(每孔血清效价可中和400RID CSFV)阻断时间为2.0h,封闭剂和血清稀释液中NaCl的浓度和Tween-20的体积分数分别为0.7mol/L和3.00mL/L,100mL/L马血清封闭剂、1∶50稀释的待检血清、0.625 mg/L HRP-家兔抗猪IgG酶标二抗(100μL/孔)及底物的反应时间分别为2.0、0.5、0.5h及15min;检测CSFV、伪犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均为阴性;4份血样进行5次板内、板间重复试验结果均一致;参照中和试验,本ELISA方法的符合率(97.9%)高于IDEXX BVDV ELISA抗体检测试剂盒(93.8%);福州市周边猪群BVDV抗体阳性率为34.7%,猪场阳性率为80.0%,其中母猪群阳性率(44.6%)高于商品猪群(26.4%)。结果表明,本ELISA方法特异性强、符合率高、重复性好,适合用于猪源BVDV的血清学监测。     

猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA的建立与应用

利用伪狂犬病病毒(PRV)ZJ01毒株重组gB蛋白及其对应的HRP标记的单克隆抗体,旨在建立一种检测伪狂犬病病毒gB抗体的阻断ELISA。对ELISA反应条件进行了优化,具体为:包被抗原的质量浓度为0.5 g/mL;待检血清的稀释比例为1∶1,孵育条件是37℃作用1 h;酶标单抗的稀释度为1∶15 000,作用时间为37℃0.5 h。ELISA结果的判定标准为:血清样品阻断率PI≥28.67%时判为阳性;PI≤18.27%时判为阴性;18.27%PI28.67%时判为可疑。该ELISA能特异性地识别PRV阳性血清,而与PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV阳性血清无交叉反应性。ELISA的重复性试验表明,批间和批内的变异系数均小于10%。比较试验结果表明,该ELISA的相对敏感性和特异性分别为80.9%和96.4%,与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率为85.1%。用建立的此ELISA对田间采集的535份猪临床血清样品进行了检测,结果显示,PRV抗体阳性率达61.87%。综上所述,本试验建立的猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA具有特异、简单、快速的优点,为建立标准化的检测试剂盒奠定了基础。     

猪流感病毒M2多肽抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测猪流感病毒抗体的血清学方法,利用合成的甲型流感病毒M2蛋白多肽作为包被抗原,建立了检测猪流感病毒血清抗体的间接ELISA,并对各种检测条件进行了优化。结果显示,优化后确定的抗原最适包被量为250ng/孔,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶4 000。在优化条件下,阴阳性临界值的判定标准为0.249。用建立的间接ELISA对CSFV、PRRSV、PCV2、PPV、PRV、FMDV、JEV阳性血清进行了检测,均无交叉反应。用该方法对280份冬季采集的猪血清样品进行检测,有60份样品呈现阳性;同时用IDEXX甲型流感病毒抗体检测试剂盒进行平行检测,有61份样品呈现阳性,两者的符合率达到98.35%。结果表明,建立的ELISA具有良好的敏感性、特异性和可信度。本研究为猪流感的诊断和流行病学调查提供了一种准确、快速、简便的方法。     

副猪嗜血杆菌不同血清型稳定表达蛋白的筛选及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种能够检测不同血清型副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA,选用了在4、5、12型副猪嗜血杆菌中稳定表达的3种蛋白经原核表达后作为候选抗原和全菌裂解物同时包被酶标板,对临床猪血清进行副猪嗜血杆菌抗体检测,发现以锰依赖的超氧化物歧化酶(MSD)作为包被抗原得到的结果最接近用副猪嗜血杆菌全菌裂解物进行ELISA检测的结果,故确定以MSD蛋白为抗原建立间接ELISA。通过方阵滴定对ELISA反应条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:包被抗原的质量浓度为1.5μg/mL,4℃过夜;50g/L脱脂奶粉溶液37℃封闭2h;血清稀释度1∶160,37℃作用90min;酶标二抗的稀释度为1∶15 000,37℃作用45min;底物显色时间为37℃6min。抗体临界值D450nm≥0.245 1判为阳性,D450nm0.208 3判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、红斑丹毒丝菌、马链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。用建立的间接ELISA对114份临床血清进行检测,与4、5、12型全菌裂解物的ELISA检测结果比较,阳性符合率分别为80.77%、80.00%和90.00%。结果表明,建立的间接ELISA可被用于4、5、12型副猪嗜血杆菌的抗体检测和流行病学调查。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

采用超声裂解的副猪嗜血杆菌菌体上清作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法.通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度80μg/mL;37℃作用2 h后4℃过夜包被,待检血清的稀释度为1:320,抗原抗体反应时间为1 h,酶标二抗稀释度为1:15 000,作用时间为1 h,底物显色时间为15 min.待检血清S/N值≥2.5时判为阳性,S/N值<2.5时判为阴性.特异性、重复性和敏感性试验以及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法的特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查.     

赤羽病病毒核衣壳蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的重组赤羽病病毒核衣壳蛋白作为诊断抗原,建立了检测牛血清特异性核衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,初步组装成便于现地使用的试剂盒。经对试验条件进行优化,确定最佳抗原包被量为每孔1μg(100μL),样品稀释度为1∶100,兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶8 000。经特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。应用初步研制的间接ELISA试剂盒和微量中和试验法分别对云南省的89份、内蒙古的100份牛血清样本进行了检测,以中和试验为参照,经统计学处理,得出检测临界值分别为0.411和0.303,2种方法的符合率分别为72.7%(56/77)和91.4%(85/93)。试剂盒在37℃保存3 d,对敏感性无明显影响。     

猪流行性腹泻病毒抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用

用猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白单克隆抗体IgG包被酶标板,以纯化的PEDV作为捕获抗原,建立了PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法。优化后该方法的反应条件为:单克隆抗体包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h加4℃过夜;含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液作为封闭液,37℃封闭3h;捕获抗原的质量浓度为5μg/mL,37℃作用3h;被检猪血清做1∶50稀释,37℃作用1h;山羊抗猪IgG-HRP稀释度为1∶2 000,37℃作用45min;底物最佳作用时间为37℃10min。设定阴阳性血清抗体对照,计算血清样品的S/P值,S/P值≥0.37判为阳性,S/P值0.323判为阴性,介于两者之间为可疑。用建立的ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等阳性血清,结果均无交叉反应性。该方法的批间和批内变异系数均小于10%。相对国产商品化抗体检测试剂盒,其敏感性、特异性和符合率分别为94.6%、91.3%和93.3%。应用本方法检测山东、浙江和江苏省的308份猪血清样品,结果 PEDV抗体阳性率达89.29%。结果表明,建立的抗原捕获ELISA敏感性、特异性和重复性良好,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。     

基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用

本研究旨在原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epizootic diarrhea virus,PEDV)的核衣壳(N)蛋白,以重组N蛋白作为包被抗原建立PEDV血清抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。克隆PEDV N基因并将其插入到原核表达载体p ET-28a中,转化BL21感受态细胞进行诱导表达,对表达的N蛋白进行镍柱纯化及Western-blot鉴定;将纯化的N蛋白作为包被抗原并优化反应条件,建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达得到大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot检测表明N蛋白具有良好的特异性和反应原性。PEDV间接ELISA方法的最优反应条件为抗原包被量每孔0.05 g,血清以1∶200倍稀释,作用1.0 h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释,作用1 h,TMB显色时间为25 min。在该优化条件下,D4500.269为阳性,反之为阴性。特异性试验表明,对PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;对96份阳性血清进行检测,敏感性为98.9%。重复性试验表明,批内变异系数0.99%~2.33%,批间变异系数3.54%~6.67%。用本试验建立的体系对临床上164份血清进行检测,阳性率为56.7%,与标准试剂盒的符合率为95.1%。总之,本试验建立的基于原核表达的N蛋白作为检测抗原的PEDV血清间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、重复性好,可用于临床PEDV血清抗体的检测。     

旋毛形线虫P53重组蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的旋毛形线虫P53排泄分泌(ES)重组蛋白作为包被抗原,建立了检测旋毛形线虫P53 ES蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件:抗原包被浓度为2/μg/mL(100 μL),血清稀释度为1∶200,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体稀释度为1∶10 000,抗原和血清于37℃反应1.5 h,血清和二抗于37℃反应1 h,底物于37℃显色10 min.应用该方法对试验小鼠血清进行检测,结果表明,建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性,适用于检测特异性P53血清抗体.     

鹅副黏病毒NP蛋白间接ELISA检测方法的建立及免疫鹅抗体水平的检测

以纯化的鹅副黏病毒NP蛋白为包被抗原,建立了检测鹅副黏病毒NP蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件:抗原包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释度为1∶200,兔抗鹅IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶2 000,抗原和血清、血清和二抗均于37℃反应1 h,底物于37℃显色15 min。此间接ELISA方法的特异性强、重复性好。应用该方法对试验鹅血清进行检测,以HI试验为参照。经统计学处理后,比较了两方法测得的抗体效价,分别建立了各组鹅群的回归方程。显著性检验证明,这两种方法检测的抗体效价呈显著相关关系。