旋毛虫ES抗原致小鼠骨髓源树突状细胞吲哚胺2,3-双加氧酶表达的影响

为探讨旋毛虫排泄分泌(ES)抗原体外诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC2.4)在不同时间点对吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达情况,将ES抗原(终浓度为15?g/mL,试验组)、重组小鼠IFN-γ(浓度为1 000 U/mL,阳性对照组)和RPMI 1640培养液(阴性对照组)加入到状态良好的树突状细胞中,并设无添加的空白对照组,分别刺激0、2、6、12、24 h后收集细胞,采用细胞免疫组织化学方法检测各组树突状细胞IDO的表达情况,实时荧光定量法检测各组IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αmRNA表达水平,W estern-blot方法检测各组IDO蛋白表达水平。结果显示,ES抗原、IFN-γ均能提高IDO在细胞质中的mRNA及蛋白表达水平,且与空白对照组呈显著性差异(*P0.05,*P0.01,***P0.001);随着刺激时间的增加,IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αm RNA及IDO蛋白表达量均显著上升,且与空白对照组呈显著性差异(***P0.001)。结果证实,ES抗原可刺激树突状细胞表达IDO,且存在一定的时间效应,可能与旋毛虫逃避宿主的免疫有一定关系。     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞后病毒复制及TLR3诱导表达的影响

本试验旨在探索猴头菇多糖(HEP)对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染RAW264.7细胞中病毒复制及TLR3诱导表达的影响,为进一步解析HEP在调节MDRV所致的番鸭机体免疫抑制中的作用机制提供数据参考。本试验首先通过测定HEP在小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)上的安全浓度的基础上确定HEP的添加浓度;然后通过RT-qPCR方法和Western-blot方法分别检测各组细胞中TLR3 m RNA的转录水平和TLR3、病毒σNS的蛋白表达量,从基因和蛋白的分子层面分析HEP对MDRV感染RAW264.7细胞的免疫调节作用。结果显示:HEP在46.88～187.5μg/m L浓度范围内是可以促进RAW264.7细胞生长,浓度为93.75μg/m L时细胞相对增殖率最高,VCG细胞TLR3 m RNA的相对表达量和蛋白表达量均极显著(P0.01)高于BCG组,HPG与HTG细胞TLR3 m RNA的相对表达量和蛋白表达量均极显著(P0.01)低于VCG组。结论:HEP可从基因与蛋白水平抑制MDRV感染早期过度活化的TLR3的表达,从而起到抗病毒作用。     

黄芪总黄酮对脂多糖体外诱导的RAW264.7细胞的细胞因子和NO分泌水平的影响

为了研究黄芪总黄酮(TFA)的体外抗炎作用,通过脂多糖体外诱导小鼠RAW264.7细胞建立炎症模型,采用MTT法检测黄芪总黄酮的细胞毒性作用,用ELISA检测细胞上清液中IL-6、IFN-γ、IL-1β及TNF-α水平,采用Griess法检测细胞内NO表达水平。MTT结果显示,10~100μg/mL TFA对RAW264.7细胞没有明显的毒性作用。与模型组比较,10、25、100μg/mL TFA均能抑制RAW264.7细胞过量分泌IL-6、IFN-γ、IL-1β、TNF-α及NO,且呈一定的量效关系。本试验结果表明黄芪总黄酮具有体外抗炎活性。     

鸡枞菌多糖对小鼠T细胞免疫功能的影响

采用鸡枞菌多糖(TAP)体外作用于小鼠T淋巴细胞,用ELISA法检测其IL-4、IFN-γ及IL-2水平,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群,RT-PCR法检测相关细胞因子mRNA表达量,观察研究了鸡枞菌多糖对小鼠T细胞免疫功能的影响。结果表明,与ConA组相比,25～100μg/mL TAP在作用72h内均能显著促进T细胞产生IL-4、IFN-γ及IL-2(P<0.01);25μg/mL TAP作用48h后可显著降低被ConA激活的T细胞CD4+%(P<0.01),升高CD8+%(P<0.05),并降低CD4+/CD8+(P<0.05);50μg/mL TAP则可显著升高CD3+%(P<0.01);50μg/mL TAP在作用72h内能显著提高IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达量(P<0.01),并使其保持较高水平。提示,TAP对细胞免疫功能具有显著增强作用,T淋巴细胞是TAP的靶细胞之一。     

中华鳖TLR2部分序列的克隆及其组织表达差异分析

为探究中华鳖天然免疫的分子机制,针对TLR2(Toll-like receptor 2)保守区设计兼并引物,从中华鳖脾cDNA中扩增出了740bp的目标序列。测序和序列分析结果表明,该序列包含富含半胱氨酸型C端结构域、跨膜结构域和TIR结构域;与斑马鱼、鸡等脊椎动物相应的TLR2序列相似性为60.5%～74.4%。采用荧光定量PCR检测中华鳖感染嗜水气单胞菌后各组织TLR2mRNA表达的变化,结果显示,感染后第24小时,中华鳖脾和外周血TLR2mRNA相对表达水平升高,其中外周血中的增幅最显著,是对照组的8.57倍;中华鳖外周血经4μg/mL酵母聚糖刺激后,第2小时TLR2mRNA相对表达水平较高。首次获得了中华鳖TLR2部分cDNA序列,并分析了不同刺激物对中华鳖TLR2mRNA转录的影响。     

脂多糖诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB的表达

通过研究脂多糖(LPS)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB亚单位P65蛋白mRNA的表达变化,从细胞水平深入探讨子宫内膜炎的发病机理。将奶牛子宫内膜上皮细胞传代培养,采用1、10、50、100、1000μg/mL五个浓度梯度的LPS刺激子宫内膜上皮细胞,MTT法筛选最佳刺激浓度;以上述最佳刺激浓度刺激细胞,于0、0.5、1、2、4h后收集细胞,荧光定量RT-PCR检测p65 mRNA的表达差异性。结果显示,100μg/mLLPS为最佳刺激浓度;LPS刺激1h组p65 mRNA的表达极显著(P0.01)高于其他时间组;2h组显著(P0.05)高于0、0.5和4h组;0.5和4h组显著(P0.05)高于0h组。结果表明,LPS可诱导奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB的激活,LPS介导的NF-κB信号通路存在于奶牛子宫内膜上皮细胞中,并参与子宫内膜炎发病机理的调控。     

MicroRNA-181a对日本血吸虫童虫抗原刺激巨噬细胞的免疫应答起负调节作用

用日本血吸虫童虫抗原SSA和miR-181a模拟物分别或共同刺激/转染RAW264.7巨噬细胞,再用实时定量PCR技术或流式细胞术分析细胞miR-181a和TNF-α等细胞因子及M1型和M2型巨噬细胞标记分子的表达变化。结果显示,日本血吸虫童虫抗原SSA刺激RAW264.7细胞后,miR-181a及IL-1β、IL-4、TNF-α、IL-10、IL-6等促炎因子上调表达,IL-13下调表达;miR-181a模拟物单独转染RAW264.7巨噬细胞后,细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和M1型巨噬细胞标记分子INOS等下调表达,IL-4和M2型巨噬细胞标记分子arg-1上调表达。巨噬细胞先用SSA刺激后再转染miR-181a模拟物,IL-1β、IL-4、TNF-α、IL-10、IL-6等促炎因子都下调表达。流式细胞术分析结果显示,miR-181a对M1型标记物CD16/32的表达起到下调作用,对M2型标记分子CD206的表达起上调作用。本研究提示miR-181a对日本血吸虫SSA抗原刺激的巨噬细胞的免疫应答可能起负调节作用,并促进巨噬细胞向M2型细胞转化。     

大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1和NF-κB及TLR4表达的影响

为研究大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1表达的影响以及对其信号转导通路Toll样受体4(TLR4)的表达和核转录因子κB(NF-κB)活化的影响,采用热灭活的不同浓度大肠杆菌菌液(0、1×105、1×106、1×108 CFU/mL)作用于奶牛乳腺成纤维细胞,分别于不同时间点(作用后第6、12、24、48小时)运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TGF-β1和TLR4mRNA的表达,运用Western-blot检测TGF-β1、TLR4和p-NF-κB-p65蛋白的相对表达量。结果显示,大肠杆菌作用BMFB后,TGF-β1mRNA和蛋白的表达量显著的升高,并且TGF-β1mRNA的表达呈明显的时效及量效关系,于第24小时达到高峰后降低(P0.05);TGF-β1蛋白的表达量呈量效性(P0.05)。TLR4mRNA和蛋白表达水平显著升高,并且TLR4mRNA和蛋白的表达呈时效性和量效性,分别于作用后第24和12小时达到最高后逐渐下降(P0.05)。p-NF-κB-p65的表达与大肠杆菌作用浓度呈正量效关系,表达量随作用时间延长先升高后逐渐降低(P0.05)。上述研究结果表明,热灭活的大肠杆菌能够促进BMFB的TLR4表达,并激活BMFB p-NF-κB-p65蛋白的表达,从而促进TGF-β1的表达。     

阿维菌素对体外培养王鸽神经细胞内游离钙离子浓度及CaM mRNA表达的影响

提取美国王鸽8～9日龄鸽胚脑神经细胞进行体外培养,按照阿维菌素(AVM)染毒的剂量分成4组,分别为0ìg/L(Ⅰ组)、2.5 ìg/L(Ⅱ组)、5 ìg/L(Ⅲ组)和10 ìg/L(Ⅳ组),染毒24 h后,用MTT法进行细胞活性检测,应用荧光探针法检测细胞内游离Ca2+浓度,应用半定量RT-PCR法检测细胞内CaM mRNA的表达水平.结果显示,AVM能够引起王鸽神经细胞内游离Ca2+浓度升高,CaM mRNA表达水平下降.表明AVM能影响王鸽体外培养神经细胞内的钙稳态.     

猪链球菌2型39ku胞壁蛋白诱导巨噬细胞凋亡的研究

为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)的39ku胞壁蛋白对巨噬细胞的致病作用,将39ku胞壁蛋白纯化,取小鼠腹腔巨噬细胞(murine peritoneal macrophage,MPM)和39ku胞壁蛋白(4μg/mL和40μg/mL)共孵育,用荧光显微镜观察细胞的形态学变化,以不同浓度(4～50μg/mL)39ku胞壁蛋白腹腔注射小鼠,作用6h,用DNA Ladder法检测MPM凋亡情况,以40μg/mL腹腔注射,分别作用2、4、6、8h,用流式细胞术检测MPM凋亡率,同时用试剂盒比色法检测其Caspase 3的表达动态。结果显示,低浓度(4μg/mL)诱导后MPM未见异常形态改变;而高浓度(40μg/mL)能引起典型的凋亡形态学变化,低浓度(4μg/mL)诱导后,DNA图谱与阴性对照相同;而高浓度(20～50μg/mL)诱导后均出现典型的DNALadder,且随39ku胞壁蛋白浓度增加,梯状条带更加清晰。流式细胞分析表明,MPM的凋亡率随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而增加,与对照组之间均差异极显著(P<0.01);Caspase 3的表达量随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而上升,各时间点之间均差异显著(P<0.05)。结果表明,39ku胞壁蛋白可以诱导MPM高水平凋亡,凋亡率与39ku胞壁蛋白的作用浓度和时间之间正相关,39ku胞壁蛋白可单独作为SS2的毒力因子。     

TGF-β1对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA表达的影响

为研究外源性TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞表达CTGF mRNA的影响,用组织块法体外培养和纯化出奶牛乳腺上皮细胞,并应用免疫组织化学的方法鉴定细胞的纯度。然后用不同浓度的外源性TGF-β1(0,1,5,10ng/mL)作用乳腺上皮细胞,作用12,24,48,72h后分别提取细胞的总RNA,以β-actin作为内参基因,用实时荧光定量RT-PCR方法测定CTGF mRNA相对表达量的变化,并对CTGF的PCR产物进行测序分析。结果显示,TGF-β1处理组(1,5,10ng/mL)较对照组(0ng/mL)差异显著(P<0.05);处理组CTGF mRNA的相对表达量显著升高,并呈正量效关系:随着TGF-β1浓度的升高,CTGF mRNA的相对表达量基本呈逐渐升高的趋势。测序分析结果证明扩增产物为牛的CTGF基因序列,表明外源性TGF-β1可显著促进奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA的表达,进而在奶牛乳腺纤维化过程中发挥作用。     

鸭源新城疫强毒株对番鸭细胞因子及Toll样受体mRNA表达的影响

为研究人工感染鸭源新城疫强毒株(Md/CH/LGD/1/2005)诱导番鸭细胞因子及Toll样受体基因的表达情况,选用80只15日龄SPF番鸭,随机分为攻毒组和对照组,每组各40只,攻毒组以滴鼻点眼的方式接种1×107.0EID50鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)Md/CH/LGD/1/2005,对照组接种灭菌的磷酸盐缓冲液。分别在攻毒后36 h、72 h、7 d和25 d剖杀10只番鸭,采集每只番鸭的骨髓、脾、盲肠扁桃体、哈德氏腺和法氏囊样品,通过Real-time RT-PCR方法检测组织中NDV载量、细胞因子和Toll样受体基因的表达。结果显示,除哈德氏腺外,其余各组织中病毒含量在攻毒后72 h达到最高,对照组各组织中均未检测到病毒含量。与对照组相比,经NDV感染后,IL-1β在攻毒36 h的法氏囊和攻毒7 d的哈德氏腺中表达量显著上调(P<0.05);IL-2、IL-6、IL-18和IL-20在攻毒7 d的脾内表达显著上调(P<0.05)。TLR3、TLR15和TLR21均在法氏囊内高表达(P<0.05),且表达趋势相同,对NDV感染的应答可能具有协同效应。TLR5在骨髓、脾、盲肠扁桃体和法氏囊内显著上调(P<0.05);TLR7在攻毒7 d的骨髓和法氏囊内表达上调(P<0.05)。结果表明,感染NDV后番鸭可能通过TLR相关的信号转导通路诱导宿主免疫抗性基因的表达,调控机体的抗病毒免疫应答反应。     

胸腺九肽对鸡脾淋巴细胞增殖转化及IL-2基因表达与分泌的影响

采用MTT比色法、相对半定量RT-PCR法和放射免疫测定(RIA)法研究了不同浓度的胸腺九肽对离体培养的鸡脾淋巴细胞增殖转化I、L-2基因表达与分泌的影响。结果表明,用10 ng/mL和1 ng/mL胸腺九肽处理鸡脾淋巴细胞8 h后,能显著增加由ConA诱导的淋巴细胞增殖转化反应,显著提高IL-2基因的表达水平以及细胞培养上清液中的IL-2含量(P<0.05);100 ng/mL的胸腺九肽虽有增强脾淋巴细胞增殖转化反应以及提高IL-2基因表达和分泌能力的趋势,但与对照组无显著差异(P>0.05)。提示,胸腺九肽能增强鸡脾淋巴细胞的增殖转化反应,并主要在基因转录水平上促进IL-2的合成与分泌,其作用与剂量大小有关。     

白鸡屎藤挥发油抗肠炎沙门菌内毒素作用的分析

为了探讨白鸡屎藤挥发油抗肠炎沙门菌内毒素的作用,将420只7日龄三黄鸡随机分成A、B、C、D、E、F组并对A、B、C组鸡按100μg/mL(1mL)预防用药,在12日龄时对A、B、D、E组口服肠炎沙门菌攻毒,攻毒24h后对A、D组按100μg/mL白鸡屎藤挥发油1mL进行滴鼻给药治疗,同时将不同质量浓度的白鸡屎藤挥发油与内毒素混合对另外90只雏鸡进行肌肉注射攻毒,并进行试验鸡与攻毒鸡临床死亡情况统计、病理组织学观察和肝与血液生化指标测定。结果显示,白鸡屎藤挥发油对肠炎沙门菌内毒素具有灭活作用,可缓解血清ALT和AST活性的升高或使其降低(P<0.01或P<0.05),提升肝及血清中SOD的活性(P<0.01或P<0.05),使肝中MDA含量下降和延缓其升高。结果表明,白鸡屎藤挥发油具有抗肠炎沙门菌内毒素的作用,其机理与其保肝作用和抗氧化损伤作用有关。     

胸膜肺炎放线杆菌感染对猪血液生化指标的影响

将24头健康DLY仔猪按性别、体重随机分为2组,采用鼻腔喷雾法分别接种生理盐水(对照组)和含3.8×107 CFU/mL胸膜肺炎放线杆菌(APP)的稀释液(试验组),研究了APP感染对猪血液生化指标的影响。血液生化指标由Airone-200RA全自动生化分析仪检测。结果显示,与对照组猪相比,试验组猪血清中TP含量略有升高(P>0.05),GLB含量极显著升高(P<0.01),ALB含量、A/G值极显著下降(P<0.01);ALT、AST活性升高,其中AST活性升高极显著(P<0.01),而LT/ST值下降显著(P<0.05);IBIL、TBIL浓度及IB/DB值极显著升高(P<0.01),DBIL浓度略有下降(P>0.05);BUN、CRE浓度均略有升高(P>0.05);GLU浓度、AKP活性极显著下降(P<0.01),Ca浓度及Ca/P值极显著下降(P<0.01),P浓度显著升高(P<0.05)。结果表明,胸膜肺炎放线杆菌感染引起了猪严重的肝功能代谢障碍,血糖和血钙显著下降,肾排泄负荷增加。     

PTD-FNK蛋白对水牛精子的冷冻保护作用

PTD-FNK蛋白可以穿透细胞膜进入细胞内发挥抗凋亡作用,抵抗各种不利因素造成的细胞死亡,但国内未见将其加入水牛精液稀释液抑制精子冷冻凋亡的报道。本试验中,在水牛精液冷冻稀释液中添加不同浓度(0、0.1、1、10、100 nmol/L)的PTD-FNK蛋白,冻后检测精子常规质量指标的同时检测精子凋亡相关基因(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因)mRNA表达和Caspase-3蛋白酶的活性;最后以最优PTD-FNK蛋白浓度批量生产冷冻精液,选择50头广西地方母水牛进行人工授精试验。结果显示:①1 nmol/L组精子质膜完整性和10 nmol/L组精子活力显著高于对照组(P<0.05),1 nmol/L组精子活力和1、10 nmol/L组精子活率极显著高于对照组(P<0.01),而100 nmol/L组精子活率却极显著低于对照组(P<0.01);②1 nmol/L PTD-FNK蛋白显著降低冻后精子Caspase-3 mRNA表达(P<0.05);③人工授精后第60天受胎率达60%,略高于其他研究者取得的受胎率(56.25%,P>0.05)。总之,PTD-FNK蛋白可以显著提高水牛精子冻后质量,其机制之一可能是它显著抑制了冻后精子Caspase-3 mRNA的表达;以PTD-FNK蛋白冷冻的水牛精液实施人工授精后可以取得比现有水平更高的受胎率。     

FSH对仔猪睾丸支持细胞增殖和GDNF表达的调节

以原代培养的仔猪睾丸支持细胞(SC)为试验模型,研究了FSH对SC胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达及其增殖的影响。结果显示,外源性添加FSH可促进GDNF蛋白表达,而且这种促进作用具有浓度和时间依赖关系,GDNF蛋白水平随着FSH浓度的增加而升高,当FSH浓度为50 ng/mL时,GDNF水平达到最高,然后逐渐降低;FSH(50 ng/mL)作用30 min,可显著促进GDNF蛋白的表达(P<0.05),当FSH作用1 h时,GDNF蛋白水平达到最高,随后逐渐降低。FSH可以时间-剂量依赖性促进SC增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,FSH(50 ng/mL)作用30 min时,PCNA的表达显著增加(P<0.05),作用1 h达极显著水平(P<0.01),至2 h时,PCNA蛋白的表达水平达到最高,随后逐渐降低。提示,FSH可在体外条件下通过刺激SC表达GDNF进而促进其增殖。     

Ⅰ群禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

为建立一种检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVⅠ)抗体的间接ELISA方法,以FAVⅠhexon重组蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立了FAVⅠ抗体间接hexon-ELISA检测方法。抗原最佳包被浓度为10.0μg/mL,最适包被条件为37℃2h加4℃过夜;最佳封闭液为50g/L脱脂乳;血清最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为75min;酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 000,最佳作用时间为45min;hexon-ELISA阴性、阳性临界值为0.379。用建立的hexon-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为45%。结果表明,建立的hexon-ELISA方法简便、快捷,可大批量检测,具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于FAVⅠ的诊断、抗体水平监测及流行病学调查。     

羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究

为研究羊口疮病毒(ORFV)新型亚单位疫苗,设计了ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白,命名为HBBH并经原核表达和鉴定。以不同剂量HBBH不加或加不同佐剂,经滴鼻或颈部皮下注射免疫BALB/c小鼠,其中滴鼻共4组(HBBH 10μg、20μg、30μg和20μg+LTB),注射组(HBBH 20μg+201佐剂)。同时设ORFV组织灭活抗原+201佐剂注射免疫对照和空白对照,每组共免疫3次,每次间隔7 d。HBBH间接ELISA检测一免、二免、三免后7 d以及三免后14 d血清中ORFV IgG、IgA和三免后14 d肺灌洗液sIgA的抗体水平,取不同水平的IgG ELISA阳性血清检测细胞中和抗体效价。结果显示,表达并鉴定了具有良好反应原性的包含ORFV B2L蛋白优势抗原表位的截短重组蛋白HBBH。免疫小鼠试验结果表明,不同剂量HBBH通过滴鼻或颈部皮下注射均可刺激小鼠产生ORFV特异性IgG抗体,20μg HBBH+201佐剂注射免疫能最大刺激小鼠血清IgG抗体的产生。实验小鼠三免后14 d肺灌洗液特异性sIgA仅在HBBH滴鼻免疫剂量≥20μg的三个组中检测到,其中30μg HBBH组刺激小鼠产生了最高水平的sIgA。在同为20μg HBBH滴鼻免疫时,添加LTB佐剂刺激小鼠产生了更高水平的sIgA。表明一定剂量的HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫可更好地刺激小鼠产生sIgA。HBBH间接ELISAIgG阳性血清的细胞中和抗体效价可高达1:128,且能中和4株ORFV分离株。结果表明,20μgHBBH+201佐剂注射免疫3次和20μg HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫3次均能刺激BALB/c小鼠产生高水平的抗ORFV血清中和抗体IgG和黏膜抗体sIgA。本研究为ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白作为亚单位疫苗提供了数据支持。