猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型猪体共感染发病模型的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)多以混合感染的形式,广泛存在于世界各地的猪群。本研究选取35日龄的阴性健康猪,随机分为4组:PCV2感染组(n=5)、PCV2+PRRSV共感染组(n=5)、PRRSV感染组(n=5)和空白对照组(n=4)。攻毒后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重并于不同时间采血,攻毒后第21天剖杀所有猪,荧光定量PCR检测血清中病毒血症和组织中病毒载量。结果表明,PCV2+PRRSV共感染组猪的临床症状最严重,并死亡2头。病理变化主要表现为肺出血、明显的间质性肺炎,淋巴组织及淋巴细胞缺失严重,淋巴滤泡中出现大量核浓缩深染的淋巴细胞;PCV2单独感染组与PRRSV单独感染组猪的临床症状轻微,仅出现短暂性体温升高;空白对照组未出现症状。病毒血症检测结果显示,两种病毒共感染组猪的血清中PCV2与PRRSV含量均高于单独感染组。本研究成功建立了PRRSV与PCV2猪体人工共感染发病模型,为PRRSV与PCV2协同致病机理研究奠定了基础。     

西宁市猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了西宁市8个规模养殖场和部分散养户的161份猪血清样品的猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果显示,所有被检猪场均有PCV2抗体阳性猪存在,161份血清样品中PCV2抗体阳性率为86.95%。从上述样品中随机抽取28份样品,用PCR方法检测了PCV2 ORF1基因;结果,从13份血清中扩增到了特异性PCV2 ORF1基因,阳性率为46.42%。证实,西宁市猪场和散养猪群中存在PCV2感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型双重荧光PCR检测方法的建立

为建立快速简便检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本研究根据GenBank中已登录的PRRSVORF7基因序列和PCV2 ORF1基因序列,设计了2对特异性引物和2条TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测PRRSV和PCV2的双重荧光PCR方法。结果显示,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,检测PRRSV和PCV2的灵敏度分别可达1.05 TCID_(50)/100L和6.30 TCID_(50)/100μL,表明,本试验建立的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法可对PRRSV和PCV2进行快速诊断,适合现场检测,为这两种疫病的诊断和防控奠定了基础。     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

猪圆环病毒3型RAA检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)的快速简便检测方法,根据PCV3 Cap基因的保守序列设计多对引物和探针,建立了一种实时荧光RAA检测方法。通过筛选引物和优化试验条件,验证对常见动物疾病病毒的特异性,并与PCR方法在敏感性上进行比较。结果表明,PCV3与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)等核酸无交叉反应,可在39℃下20 min内快速特异完成。该方法灵敏度较高,最低检出浓度为10~2copies/μL。应用该方法对115份猪临床样品进行检测,检测结果与PCR方法一致。结果表明,该方法操作简单、快速灵敏、结果可靠,可用于PCV3的实验室检测和现场诊断。     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀,对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明,用所获得的3 株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外,用IIF检测7 头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片,其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应;对这2头猪的肺组织进行病毒分离,在盲传到第4代时Marc 145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠,且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

猪圆环病毒分离鉴定及猪断奶多系统衰弱综合征的诊断

剖检北京、河北某些猪场发生的仔猪先天性震颤、断奶后发育不良、咳喘、消瘦、黄疸等症状的病猪,均显示猪断奶多系统衰弱综合征(PMWS)的病理学变化;电镜观察病猪的脾和淋巴结组织样品,见细胞核内堆积大量无囊膜的病毒粒子;进而从病猪的病料中分离到2株猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV).经电镜观察细胞内增殖、浓缩、提纯的病毒,为直径约17 nm的无囊膜的病毒粒子;间接免疫荧光试验可观察到PCVⅡ特异性免疫荧光;用2对引物分别扩增分离毒株,均得到2条与PCVⅡ特异性核苷酸片段大小一致的扩增片段.     

猪圆环病毒2型基因型鉴别PCR检测方法的建立

采用PCR方法从猪圆环病毒2型(PCV2)山东分离株中扩增ORF2基因片段,结合GenBank中已登录的PCV2基因序列进行同源性分析及基因型鉴定,确定山东省PCV2的流行优势基因型,探讨PCV2基因的遗传变异特性。依据PCV2基因型间的差异性序列,设计、合成特异性PCR引物,建立PCV2基因型鉴别PCR检测方法,并从敏感性、特异性、重复性等方面评价其性能。结果,获得了28株PCV2ORF2完整基因,其中4株为PCV2a型,21株为PCV2b型,3株为新基因型PCV2d型,显示山东省流行的PCV2优势基因型为PCV2b。基因同源性分析表明,2000-2012年国内不同地区分离株的基因同源性为90.5%~99.8%,不同基因型PCV2存在一定形式的特有氨基酸位点序列。用建立的PCV2基因型鉴别PCR方法扩增的片段大小分别为341bp和177bp,该方法最低能检测病毒DNA的量为5ng/μL;特异性试验结果显示,该方法只对PCV2a和PCV2b的DNA扩增阳性,而对猪圆环病毒1型(PCV1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)和大肠杆菌(Escherichia coli)的扩增结果均为阴性;重复检测10次的结果均一致。结果表明,建立的PCR方法具有良好的特异性和重复性,可用于PCV2基因型的鉴别检测。     

四种猪呼吸道疾病综合征病原多重PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)和猪肺炎支原体(M.hyo)的多重PCR方法,分别针对PRRSV的ORF1a基因、PCV2的ORF2基因、APP的OMLA基因和M.hyo的P46基因的保守区域设计4对特异性引物,优化反应体系及条件,建立了可同时扩增PRRSV(225bp)、PCV2(337bp)、APP(107bp)、M.hyo(176bp)相应基因的四重PCR方法。结果显示,该方法能单管同时特异地鉴别检测PRRSV、PCV2、APP、M.hyo 4种病原体,对猪瘟病毒、副猪嗜血杆菌、猪呼吸道冠状病毒、猪流感病毒、猪细环病毒及猪细小病毒等无特异性扩增,说明该PCR具有良好的特异性;方法的灵敏度分别为195、272、241、321pg/μL。应用该方法对重庆市的61份样品进行检测,其中PRRSV、PCV2、APP、M.hyo的阳性率分别为22.9%(14/61)、18.0%(11/61)、8.2%(5/61)和18.0%(11/61)。该方法的建立为临床上4个病原的快速鉴别诊断提供了有力的技术手段。     

PCV2-PRV-PRRSV-CSFV多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的有关基因序列,设计4对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gH基因、PRRSV的ORF7基因和CSFV的5′UTR基因的目的片段,建立了同时检测4种病毒的多重PCR。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对这4种病毒的最低核酸检出量分别为48.1pg(PCV2)、29.6pg(PRV)、54.2pg(PRRSV)和62.8pg(CSFV)。该方法可同时扩增440bp(PCV2)、359bp(PRV)、321bp(PRRSV)和186bp(CSFV)的特异性片段,而对牛流行性腹泻病毒、猪流行性腹泻病毒和猪细小病毒的检测结果均为阴性。多重PCR与单一PCR的符合率为100%。结果表明,该方法可用于这4种病毒的临床快速检测与流行病学调查。     

猪圆环病毒1型抗体IPMA检测方法的建立及应用

建立了一种用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法.对该方法的反应条件、特异性、敏感性及重复性等进行了系统试验,并与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测结果进行了比较.结果显示,用IPMA法对已知PCV1和猪圆环病毒2型(PCV2)参考阳性血清进行检测,血清稀释度≥1:100即可消除2种病毒间的低水平交叉反应,与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应;与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测符合率为88.9%.用该方法对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%,PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在.建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,不失为PCV1流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段.     

广西断奶仔猪猪圆环病毒2型的检测

对广西 16个养猪场的 2 2份断奶仔猪病料用PCR技术检测猪圆环病毒 2型 (PCV 2 ) ,对阳性病料进一步检测猪瘟病毒、猪生殖和呼吸系统综合征病毒、伪狂犬病病毒及细菌性病原。结果 ,从南宁市郊某猪场表现衰弱症状的病猪病料中检测出PCV 2 ,而这些病料没有检出猪瘟病毒、猪生殖和呼吸系统综合征病毒、伪狂犬病病毒及可疑细菌 ,证实广西存在PCV 2引起的断奶仔猪多系统衰弱综合征 (PMWS)。     

三种猪繁殖障碍性病毒混合感染的分子生物学调查

根据GenBank登录的PRRSVORF7、PCV 2ORF1基因及PRVTK基因的核苷酸序列设计合成引物 ,建立了分别用于检测PRRSV、PRV及PCV 2的RT PCR及PCR方法。应用该方法对 77份可疑病料进行了检测 ,以调查猪群中PCV 2与PRRSV和 (或 )PRV混合感染情况。结果表明 ,2 4份样品表现为PRRSV与PCV 2混合感染 ,占样品总数的 31.2 % ;17份样品检测为PRRSV与PRV混合感染 ;9份样品表现为PCV 2与PRV混合感染 ,占 11.7% ;另外 ,还有一定比例的三重感染 ,共 8个样品 ,占 10 .4 %。结果显示 ,猪群中PRRSV、PRV与PCV 2的混合感染现象比较普遍     

猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染的6周龄仔猪,于感染前和感染后第3、7和10 d,采用血常规法、SWC3a单色流式细胞术以及CD3/CD4/CD8三色流式细胞术分析了感染猪外周血中白细胞、粒细胞、单核细胞、NK细胞、γδT细胞的含量。结果,感染后第3 d和第7 d,PRRSV感染组、PCV2感染组以及PRRSV+PCV2共感染组猪的白细胞、单核细胞、粒细胞、NK细胞、γδT细胞总数显著下降,并且共感染组比单感染组下降更加严重。结果表明,PRRSV+PCV2共感染对仔猪外周血天然免疫细胞的影响具有协同效应,意味着在感染早期可导致更加严重的先天免疫抑制。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-LAMP检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守序列各设计一套LAMP引物,在同一体系中进行RT-LAMP扩增,通过对体系内引物浓度及反应温度等进行优化,建立了可在63℃恒温下对CSFV和PRRSV进行同步检测的LAMP方法,并进行了敏感性和特异性试验。结果显示,该方法的灵敏度与荧光定量RT-PCR相当,与常规RT-PCR相比高10倍;用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行RT-LAMP扩增,均未发生交叉反应。用该法对采自天津市4个猪场的52份临床样品进行检测,与荧光定量RT-PCR检测结果的符合率为100%。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,可实现两病原的同步快速检测,是临床疫病初筛技术的强有力候选。     

非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组中序列保守稳定的B646L基因设计特异性引物和探针,建立了敏感、特异、高效的ASFV核酸RPA快速检测法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测ASFV核酸,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等灭活病毒核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到2×101copies/uL;检测时间短,15 min即可完成反应;重复性好。采用ASFV灭活抗原和猪血液制备模拟临床猪血样品,能检出灭活抗原的稀释度为1∶12 800,应用该方法对200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血进行检测,结果均为阴性,与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。本研究建立的RPA快速检测法操作简便,尤其适合ASFV现场快速检测。     

猪圆环病毒2型套式PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的猪圆环病毒 2型 (PCV2 )的全基因组序列 ,设计了 2对引物 ,建立了检测PCV2的套式PCR方法。对该方法用序列分析、酶切等方法进行了鉴定。同时用该套式PCR方法对华南地区 2 87个猪场的 15 6 0份样品进行了检测 ,结果 ,983份为PCV2阳性 ,阳性率为6 3%。     

猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种猪圆环病毒2型(PCV2)抗体检测方法,以胶体金标记PCV2dcap蛋白(PCV2dcap蛋白为cap蛋白去除N端信号肽的截短蛋白)包被检测线、PCV2dcap蛋白的单克隆抗体包被质控线。用制备的试纸条分别检测了PCV2、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、甲型流感病毒(H3N2)的标准阳性血清以及浙江省不同猪场的479份临床血清,并同瑞普(保定)生物药业有限公司生产的ELISA试剂盒的检测结果进行了比较;制备了5个不同批次试纸条,通过批内和批间差异试验数据来衡量试纸条的稳定性。结果显示,该试纸条仅同PCV2的阳性血清有反应性,同上述常见猪病病毒的阳性血清没有交叉反应性;该方法同ELISA的阳性符合率为99.57%,阴性符合率为100%,总符合率为99.58%;试纸条的批内变异系数小于2.50%,批间变异系数小于7.60%。结果表明,该方法可用于PCV2相关疾病的快速诊断、流行病学调查以及疫苗免疫效果的评估,对PCV2相关疾病的监测和预防具有重要意义。