牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定

为进一步研究牛IFN-γ(BoIFN-γ)单克隆抗体在牛免疫学以及牛疫病诊断中的应用,用原核表达的重组牛IFN-γ(rHis-BoIFN-γ)免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,免疫3次后取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经3～5次亚克隆,最终获得12株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株。Ig亚类鉴定结果显示这12株杂交瘤细胞均为IgG,其中5株为IgG1,3株为IgG2a,4株为IgG2b。这12株杂交瘤细胞在体外具有稳定分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的能力。Western-blot及间接ELISA证明这12株单克隆抗体均可特异性地结合rBoIFN-γ蛋白。间接免疫荧光试验显示,这12株单抗均与真核细胞BHK-21表达的rBoIFN-γ产生荧光反应,证明这些单抗能够与接近天然的BoIFN-γ反应,证实了单抗的特异性。ELISA叠加试验表明,3C2与1H4、1G6与1G4针对不同表位,1A10、1B2、2B9、3C4四株和1C1与1G6、1G4与3C2、1A10与1G8针对相同或相近的表位。     

羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究

为研究羊口疮病毒(ORFV)新型亚单位疫苗,设计了ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白,命名为HBBH并经原核表达和鉴定。以不同剂量HBBH不加或加不同佐剂,经滴鼻或颈部皮下注射免疫BALB/c小鼠,其中滴鼻共4组(HBBH 10μg、20μg、30μg和20μg+LTB),注射组(HBBH 20μg+201佐剂)。同时设ORFV组织灭活抗原+201佐剂注射免疫对照和空白对照,每组共免疫3次,每次间隔7 d。HBBH间接ELISA检测一免、二免、三免后7 d以及三免后14 d血清中ORFV IgG、IgA和三免后14 d肺灌洗液sIgA的抗体水平,取不同水平的IgG ELISA阳性血清检测细胞中和抗体效价。结果显示,表达并鉴定了具有良好反应原性的包含ORFV B2L蛋白优势抗原表位的截短重组蛋白HBBH。免疫小鼠试验结果表明,不同剂量HBBH通过滴鼻或颈部皮下注射均可刺激小鼠产生ORFV特异性IgG抗体,20μg HBBH+201佐剂注射免疫能最大刺激小鼠血清IgG抗体的产生。实验小鼠三免后14 d肺灌洗液特异性sIgA仅在HBBH滴鼻免疫剂量≥20μg的三个组中检测到,其中30μg HBBH组刺激小鼠产生了最高水平的sIgA。在同为20μg HBBH滴鼻免疫时,添加LTB佐剂刺激小鼠产生了更高水平的sIgA。表明一定剂量的HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫可更好地刺激小鼠产生sIgA。HBBH间接ELISAIgG阳性血清的细胞中和抗体效价可高达1:128,且能中和4株ORFV分离株。结果表明,20μgHBBH+201佐剂注射免疫3次和20μg HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫3次均能刺激BALB/c小鼠产生高水平的抗ORFV血清中和抗体IgG和黏膜抗体sIgA。本研究为ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白作为亚单位疫苗提供了数据支持。     

抗鹅细小病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及对应抗原表位区的分析

以鹅细小病毒非结构蛋白NS1(GPV-NS1)的重组质粒pcDNA3.1-GPV-NS1及纯化的重组蛋白GPV-NS1为抗原,分组免疫4～6周龄的BALB/c鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并研究其部分生物学特性.结果共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株.单克隆抗体亚型鉴定结果显示,2株为IgG2a型,4株为IgM型,轻链均为κ链.用制备的单克隆抗体对分段表达的NS1蛋白进行免疫印迹分析,结果鉴定出3个抗原表位区,分别位于NS1蛋白的第453～514 aa、485～542 aa、533～598 aa区段.证实,6株杂交瘤细胞在体外长期培养能稳定地分泌抗GPV-NS1单克隆抗体.     

抗鱼类致病性嗜麦芽寡养单胞菌单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

以福尔马林灭活的嗜麦芽寡养单胞菌免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对鱼类致病性嗜麦芽寡养单胞菌的单克隆抗体(McAb),用软琼脂法进行克隆化培养,通过间接ELISA法对所得的杂交瘤细胞株进行特异性筛选,并鉴定其Ig亚类,测定腹水效价,进行了相对亲和力和抗原位点等生物学特性分析。结果显示,获得了8株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞,分别命名为1C3、1C6、4H8、3D9、2B11、3G3、2H11、1B8。经过鉴定,这8株McAb能够特异性地针对嗜麦芽寡养单胞菌,与其他测试菌之间无交叉反应;其抗体主要分为4个亚类,分别为IgG2a型、IgG2b型、IgG3型和IgM型;腹水效价均在10-6以上;相对亲和力较高;2B11针对的嗜麦芽寡养单胞菌脂多糖表位,而其余7株McAb针对的非脂多糖抗原位点。试验结果证实成功制备了能稳定分泌抗嗜麦芽寡养单胞菌McAb的细胞株,为水产养殖中该菌的快速检测和免疫学研究奠定了基础。     

猪IFN-α1重组蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其生物学特性

应用杂交瘤细胞技术,将用猪IFN-α1重组蛋白免疫的小鼠脾细胞经与骨髓瘤细胞融合、筛选和多次克隆化培养,成功获得了3株能稳定分泌抗猪IFN-α1的单克隆杂交瘤细胞株,分别将其命名为4E9、5B2和5H11。这3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经ELISA检测,体外细胞培养上清的效价均可达到1∶104,体内腹水的效价均可达1∶105;SDS-PAGE分析显示,纯化的这3株单克隆抗体的重链分子质量均在60ku以上,轻链均在30ku以上,符合抗体IgG重链、轻链分子的大小;抗体亚类鉴定表明4E9、5B2为IgG2a类,5H11株为IgG2b类,且其抗原结合位点基本一致。细胞染色体分析表明,3株杂交瘤细胞株染色体平均数为88～96条,远高于骨髓瘤细胞或脾细胞的染色体数,从遗传角度证实获得了杂交瘤细胞株;在杂交瘤细胞的稳定性试验中,这3株细胞经多次冻存复苏和传代培养,不同代次细胞上清中的抗体效价均在1∶104～1∶105之间,说明该3株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的性能稳定。     

猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定

以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别.以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠.筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11.Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应.抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF111分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链.相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位.     

鸭疫里氏杆菌脂多糖单克隆抗体的制备

将鸭疫里氏杆菌CH3株作为免疫原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后将CH3株脂多糖(LPS)作为包被抗原,筛选阳性杂交瘤细胞株。共获得2株稳定分泌鸭疫里氏杆菌CH3株LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别将其命名为7H1和8A9。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价分别为1∶12 800和1∶6 400。玻片凝集试验和悬浮荧光试验检测结果表明,2株单克隆抗体与血清1型菌株WJ4发生特异性反应,而与鸭疫里氏杆菌血清2型菌株NJ-3及血清10型菌株HXb2无反应性。Westernblot结果表明,2株单克隆抗体与LPS的反应条带位于LPS O抗原部分。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的LPS单克隆抗体,可用于进一步研究鸭疫里氏杆菌LPS的结构和致病机制。     

抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)VR株CEF适应毒制备抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术以间接ELISA筛选获得1株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞.对制备的细胞上清及腹水进行单克隆抗体特性鉴定,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS-PAGE电泳,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于90-110条,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子质量为142 ku,ELISA测定细胞上清效价为11×104,腹水效价为11×106,与其它病原无交叉反应,抗体分泌稳定.     

兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定

为建立兔出血症病毒(RHDV)的检测方法及为变异株监测做储备,用蔗糖密度梯度离心法纯化的RHDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合,以昆虫细胞一杆状病毒表达的重组VP60蛋白建立的间接ELISA法筛选抗RHDV单克隆抗体杂交瘤细胞,并对其主要生物学特性进行了鉴定.结果表明,筛选出6株单抗,它们分属于IgG1(AD4,AG10,DE2)、IgG2b(BC9,BE8)和IgM(BH3)亚类;这6株单抗杂交瘤细胞的平均染色体数为87～89条,将其冻存6个月后复苏,在体外传20代的过程中分泌的抗体效价变化不大,具有很好的稳定性;Western-blot及免疫荧光分析表明,单抗DE2、AG10识别线性表位,其余4株单抗识别构象型表位;竞争ELISA试验表明,这6株单抗可识别5种抗原表位.     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

应用杂交瘤技术获得了1株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞2D6。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,诱生腹水抗体效价达1∶6×104,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以及禽传染性支气管炎病毒(IBV)抗原之间均无交叉反应;ELISA阻断试验表明,TGEV特异性阳性血清对TGEV-McAb有明显的阻断作用,该McAb所识别的抗原是TGEV所特有的抗原决定基。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

云南省红河州山羊流产病原的调查

针对红河州山羊妊娠期流产严重的现象 ,进行了流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、实验室诊断、人工感染试验和治疗试验。结果发现 ,妊娠母山羊流产现象覆盖全州 ,且流产率以每年 11.5 0 %的速度递增 ,弓形虫抗体阳性率为 30 .82 % (12 10 / 392 5 ) ,衣原体抗体阳性率为32 .31% (12 6 8/ 392 5 ) ,其中弓形虫和衣原体双重感染阳性羊占 9.35 % (36 7/ 392 5 ) ,未检出布鲁氏菌抗体阳性羊 ;自流产胎儿肺抹片中发现弓形虫滋养体包囊 ,7份流产胎儿中有 6份分离到衣原体 ;用土霉素及复方新诺明治疗有明显效果 ;人工感染试验能复制出与自然病例相同的病例模型。调查结果表明 ,红河州广泛流行的山羊妊娠期流产的病原是弓形虫、衣原体 ,2种病原单一感染或混合感染是造成流产的主要原因。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。