血痕特异性mRNA标记研究

血痕是案发现场尤其是命案中比较常见的生物物证,而血痕的正确组织来源推断是当前鉴定工作中急需解决的问题。随着法医物证学的不断发展,以mRNA(messenger RNA)为基础的体液斑迹组织来源鉴定技术作为一种不同于传统血痕免疫学检测的新型方法,已经越加显示其独特的优越性。在该技术的基础上,实现共同提取生物物证的RNA与DNA的目标,建立体液斑迹鉴定与DNA分型兼容的方法,有利于现场重建,提高生物物证的证据效力,完善证据链。本研究建立了一个包括血痕总RNA提取、逆转录、荧光特异引物扩增、遗传分析仪电泳检测分析等步骤的血痕来源推断技术平台。实验共采集制备了40份的中国人群(女性)外周血、16份月经血样本,筛选了5个外周血标记:HBA、HBB、GYPA、SPTB、ALAS2,2个月经血标记:MMP7、MMP11,构建了一个囊括外周血、月经血特异标记的荧光复合扩增体系。结果显示mRNA技术为基础的鉴定血痕来源的方法是可行的,并且建立了血痕RNA检验的遗传分析仪结果判读方法。     

鉴别外周血与月经血的六重mRNA荧光复合检测体系构建

目的基于外周血、月经血中特异的mRNA分子标记,建立一种能有效鉴别外周血与月经血的六重mRNA荧光复合检测体系。方法通过文献及数据调研,筛选出在外周血和月经血中特异性表达的mRNA标记分子,设计并验证引物。经过总RNA提取、逆转录、多重PCR(MPCR)扩增、遗传分析仪电泳检测分析等步骤,构建一个基于毛细管电泳技术的六重mRNA荧光复合检测体系,并使用38份样本对体系进行检测验证。结果在外周血样本中检测到外周血标记(HBB、HBA)和管家基因(GAPDH、ACTB)的表达;在月经血样本中检测到所有标记(HBB、HBA、MMP7、MMP10、GAPDH、ACTB)的表达;在非血样本中只检测到管家基因(GAPDH、ACTB)的表达。结论本研究构建的六重mRNA荧光复合检测系统可以有效鉴别外周血与月经血样本。     

应用RNA分析技术推断现场血痕形成时间

目的检测血痕中β-actin mRNA和18S rRNA在人体死后8～15d期间的表达残留,为推断血痕形成时间寻找新的客观依据。方法在上述时段内每天抽提血痕总RNA,利用实时定量RT-PCR技术监测18S rRNA和β-actin mRNA的扩增状况并对产物进行定量分析,通过检测18S rRNA与β-actin mRNA含量在各个时间点的变化趋势来推测血痕形成时间。结果死后8～15 d时段内18S rRNA与β-actinmRNA量的比值呈明显升高趋势,显示出两种不同类型RNA降解的时间差异性。结论一定时段内18SrRNA与β-actin mRNA量的相对变化,可作为推测血痕形成时间的参考指标。     

人体脑组织RNA表达水平与早期PMI的相关性

目的探讨人体脑组织多种RNA指标的表达水平与早期死亡时间(PMI)的相关性。方法选取12例已知PMI(4.3~22.5 h)的个体,提取脑组织总RNA。选取8种常用RNA指标(β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9、miRNA-125b),通过实时荧光定量PCR技术检测其在脑组织中的表达水平。运用geNorm软件筛选早期PMI表达稳定的内参指标,并分析其表达水平与相关因素(年龄、性别、死亡原因)的关系。运用R软件将内参标准化的RNA指标代入前期研究建立的数学模型推断PMI,计算推断PMI的误差率以验证模型精确性。结果 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b表达稳定,其表达水平与年龄、性别、死亡原因无关。利用β-actin推断PMI的误差率为24.6%,GAPDH为41.0%。结论 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b在死亡早期表达稳定,适合作为人体脑组织的内参指标。β-actin表达水平与PMI相关性良好,有望成为推测早期PMI的辅助指标。     

不同温度下大鼠脑组织RNA降解与早期PMI的相关性

目的探讨大鼠脑组织8种RNA指标,在不同温度下的表达水平与早期死亡时间(PMI)的相关性。方法将222只SD大鼠随机分为对照组(死后0 h)和4个实验组,实验组断颈处死后分别置于5℃、15℃、25℃和35℃的环境中,于死后1~24 h内9个时间点提取脑组织RNA,利用实时荧光定量PCR技术检测8种RNA指标(β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9及mi RNA-125b)的表达水平,ge Norm软件选取合适内参,SPSS软件对内参标准化RNA指标进行回归分析,R软件构建推断PMI的数学模型,另选6只已知PMI的SD大鼠予以验证。结果 5S rRNA、miR-9和mi R-125b表达稳定,可作为内参指标。β-actin和GAPDH具有良好的时序性降解规律,在24 h内随PMI延长不断降解。R软件拟合得ΔCt值随PMI和温度变化的数学模型可用以推断PMI。运用β-actin和GAPDH验证模型的平均误差率分别为14.1%和22.2%。结论β-actin和GAPDH表达水平与PMI和环境温度相关性良好。本研究建立的数学模型可为温度变化条件下的早期PMI推断提供参考。     

不同温度下大鼠皮肤5种RNA指标与PMI的相关性

目的探讨大鼠皮肤内β-肌动蛋白(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,18S rRNA)、5S核糖体RNA(5S ribosomal RNA,5S rRNA)以及微小RNA-203(microRNA-203,miR-203)这5种RNA指标在不同温度下的表达水平与死亡时间(PMI)的相关性。方法将18只SD大鼠随机分为3组,处死后分别置于4℃、15℃和35℃的环境中,于死后0~120h内11个时间点取大鼠腹部皮肤。抽提皮肤总RNA,利用实时荧光定量PCR技术检测5种RNA表达水平。运用geNorm软件选取合适内参后,利用GraphPad软件对内参标准化的RNA指标进行回归分析。结果 5S rRNA和miR-203作为内参最合适。在4℃和15℃温度组中,β-actin和GAPDH的表达量变化与PMI线性关系良好。在35℃下,β-actin和GAPDH与PMI呈现S形曲线关系。而18S rRNA只在15℃和35℃温度组呈现一定的线性关系。结论皮肤组织比较适合作为提取RNA的检材,其中β-actin和GAPDH表达水平与PMI相关性良好,有望成为推测PMI的辅助指标。     

衰老相关生物分子标志物在法医年龄推断中的研究进展

未知个体的年龄推断能够在案件侦破、灾害遇难者鉴别及失踪人员调查等法医工作中提供重要线索。随着衰老相关生物分子标志物研究的开展，多种生物标志物被证明与年龄密切相关，如DNA甲基化、端粒长度、非编码RNA等，基于生物分子标志物构建年龄推断模型成为法医遗传学的研究热点。本文就目前常见随龄变化的生物分子标志物在法医年龄推断领域中的应用现状进行综述。     

RNA在法医学领域中的应用及研究进展

随着分子生物学的发展,遗传学证据在法庭科学领域的应用也愈加广泛.DNA技术已经在个体识别和亲权鉴定中发挥着重要作用,而RNA技术正表现出越来越广泛的应用前景.本文就RNA在推断死亡时间、血痕形成时间、损伤形成时间、死亡原因及体液来源等领域的应用进行综述.     

RNA指标在死后人体皮肤组织中稳定性研究

目的探讨多种RNA指标的表达水平在死后人体皮肤组织中的稳定性。方法收集死亡时间(PMI)明确的人体皮肤组织样本10例,提取总RNA,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测ACTB、GAPDH、18S、miR-203、5S、1et-7a、RPS29、U6共计8个RNA指标的表达水平。geNorm软件评估各RNA指标表达水平的稳定性,挑选出稳定的内参指标并分析其表达水平与相关因素(年龄、性别、死因)的关系。结果人体皮肤组织中5S、U6和miR-203表达水平最为稳定,其平均表达量与年龄、性别、及死因无关(P0.05)。结论 5S、U6和miR-203可以作为qRT-PCR方法研究PMI的理想内参指标。     

大鼠心肌组织中microRNA和18S rRNA的降解与死亡时间的相关性

目的探讨大鼠死后心肌组织中microRNA和18S rRNA的含量变化与死亡时间的关系。方法将SD大鼠断颈处死后置于25℃室温、50%湿度的环境中,于死后不同时间提取心肌组织中总RNA。利用实时荧光定量PCR检测大鼠心肌组织中miR-1-2和18S rRNA的含量变化,结果用循环阈值(Ct值)表示,分析死亡时间与Ct值的关系,最终建立死亡时间推断的回归分析方程。结果大鼠死后120h内心肌组织中miR-1-2含量无明显变化,此后开始下降;而18S rRNA含量在96 h内逐渐增多,随后开始缓慢下降。大鼠死后不同时间18S rRNA的Ct值以及18S rRNA和miR-1-2的ΔCt值与PMI呈非线性相关,二次曲线拟合的R2值分别为0.9487、0.8072。结论 18S rRNA的Ct值和18S rRNA与miR-1-2的ΔCt值与PMI之间存在明显非线性关系,可以作为早期死亡时间推断的指标。     

大鼠死后脑组织RNA降解与死亡时间推断的研究

目的探讨SD大鼠死后脑组织中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA、18s rRNA含量的比值与死亡时间(PMI)的关系。方法SD大鼠处死后分别置于15℃、20℃环境中,采用TRIzol试剂提取SD大鼠在死后即刻、1、2、3、5、7d时脑组织中的总RNA,采用RT-PCR方法与凝胶图像分析技术检测18s rRNA和GAPDH mRNA的含量,并将二者的比值(GAPDHmRNA/18s rRNA)与PMI进行统计学回归分析。结果SD大鼠死后脑组织中GAPDH mRNA在2d时降解不明显,但到3、5、7d时降解程度显著增加,且随着温度的升高,降解速度增加;而18S rRNA降解缓慢,直到7d仍无显著性降解变化,且降解速度几乎不受温度的影响。对GAPDHmRNA/18s rRNA值(Y)与PMI(X)进行回归相关分析:20℃时,Y=0.62-0.004X(R=-0.981,P<0.001);15℃时,Y=0.965-0.001X(R=-0.709,P<0.001)。结论SD大鼠死后脑组织中GAPDHmRNA和18s rRNA基因的相对稳定性即GAPDHmRNA/18s rRNA值与PMI存在明显相关性。     

大鼠死后管家基因mRNA稳定性及其时序性降解与PMI相关性研究

目的研究脑组织及骨骼肌内β-actin、GAPDH、RPL32、PKG1、SDHA、RPL13、HPRT、TBP、YWHAZ死后稳定性及其相对表达量与死亡时间(PMI)的相关性。方法取健康成年SD大鼠33只,依据据死亡时间不同随机分为11组(0h、1h、3h、6h、12h、24h、2d、4d、8d、16d、24d),分别在各时间点取大鼠胫骨前肌及脑组织约50mg,提取各组织总RNA,利用RT-q PCR技术检测9种管家基因的m RNA相对表达量。运用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件对基因稳定性进行评价,利用spss软件对内参标准化的m RNA指标进行回归分析。结果脑组织及骨骼肌中均为HPRT稳定性最高,适合用于本研究的内参基因。脑组织中SDHA、RPL32及TBP 3种指标的相对表达量变化与PMI有一定的线性关系。骨骼肌中m RNA指标相对表达量与PMI之间没有显著的相关性。结论脑组织及骨骼肌是较适宜推断晚期死亡时间的检材。脑组织中SDHA、RPL32及TBP 3种m RNA的相对表达量变化与PMI有一定的线性关系,有望成为推断PMI的辅助指标。     

实时RT-PCR常用内对照在死亡早期人心肌内的稳定性

目的探讨实时RT-PCR方法常用内对照表达水平在死亡早期人体心肌组织中的稳定性。方法选取10例具有一致的外界环境(平均存放温度25℃)、不同死亡时间(4.3～22.3 h)的个体,提取心肌组织的总RNA。选择6个常用内对照:β-actin、GAPDH、B2M、U6、18S rRNA、HSA-miR-1,通过实时RT-PCR检测其在心肌组织的表达水平。利用genormPLUS软件评估内对照在死亡早期表达水平的稳定性,挑选出最稳定的内对照并且分析其表达水平与相关因素(年龄、性别、死因)的关系。结果死亡早期心肌组织中U6表达水平最稳定,其表达量与年龄、性别及死因无关(P0.05)。结论 U6可以作为实时RT-PCR方法研究死亡时间与心肌组织中核酸降解之间规律的理想内对照。     

脑组织与法医学死亡时间推断

目前，通过脑组织推断死亡时间已经成为法医学领域研究的新热点，大量研究资料表明：死亡时间与脑组织细胞DNA、RNA、ATP含量及脑温度、脑组织血管内皮生长因子等变化有高度相关性。脑CT、MRI、磁共振波谱等检查手段对死亡时间的推断也有帮助。本文对国内外相关文献进行综述，以期为相关研究提供参考。     

基于埋葬大鼠的骨骼微生物群落演替规律推断死亡时间

目的 基于大鼠模型研究埋葬尸体骨骼微生物的群落演替规律，并以此推断死亡时间（PMI），为埋尸案件的死亡时间推断提供参考。方法 将20只大鼠埋葬于深度20 cm的土壤中，分别于5个时间点（7 d、14 d、30 d、45 d、60 d）采集上肢肱骨及下肢股骨，对细菌16S rRNA基因测序及数据分析，利用机器学习算法构建预测死亡时间的随机森林模型。结果 埋葬大鼠在60 d的分解过程中，上肢肱骨和下肢股骨微生物群落无显著差异，不同时间点微生物群落差异显著。在尸体腐败进程中，骨骼厚壁菌门、拟杆菌门相对丰度总体呈现上升趋势，变形菌门、放线菌门呈现下降趋势。利用随机森林算法筛选出与PMI相关的89个OTU作为标记物并进行预测模型的构建，其R2值可达86.32%，平均绝对误差（MAE）为2.11±1.81 d。结论 本实验基于埋葬大鼠模型所建立的骨骼微生物的死亡时间推断模型具有较好的准确性，可为埋葬案件的死亡时间推断提供参考。     

基于双能X线骨密度仪的骨折形成时间推断研究

目的 研究人体骨折部位骨矿物密度值(bone mineral density,BMD)在骨折愈合过程中的变化规律，分析其与骨折形成时间的关系。方法 共收集451例外伤性股骨骨折患者样本，其中男性233例，女性218例，年龄范围为20～79岁；采用双能X线吸收测量法，在骨折当时及骨折后2、4、6、8、10周分别对患者骨折区域R1和健侧对照区域R2进行BMD检测；应用SPSS22.0软件对数据进行统计学分析。结果 骨折患者的BMD值与年龄呈负相关，骨折区的BMD值低于正常人群，但会随着骨折时间的延长而升高，男性患者的BMD值大于女性患者，利用BMD值推断骨折时间的方程为：Y=(X₁-0.714+0.069×X₂+0.111×X₃)/0.036(X₁代表BMD值，X₂代表性别，X₃代表年龄分组，Y代表骨折时间)。结论 利用双能X线测量骨折区域的BMD值可以推断骨折形成时间，在人体损伤程度鉴定、损伤形成时间推断以及三期评定等法医临床学鉴定实践中有应用价值。     

骨骼肌circRNA在死亡时间推断中的初步筛选及验证研究

目的通过构建骨骼肌中环状RNA(circular RNA,circRNA)表达谱,筛选出人体骨骼肌中与死亡时间具有时序性变化的circRNAs,并对筛选出的circRNAs进行验证,进而探讨其相对表达量与死亡时间的相关性。方法芯片实验选取2例外界温度、湿度相对一致,已知死亡时间在24 h内的个体,分别于尸检即刻(12 h以内)、3、5、7、10 d各取50 g组织进行总RNA提取,并进行逆转录、探针标记、基因芯片检测等实验,初步得到circRNA表达谱;对筛选出的circRNAs在后续收集的18例检材中进行验证,对所得数据进行统计分析。结果骨骼肌组织中共检测出13156个circRNAs,但在10 d内整体呈下降趋势的circRNAs只有hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0000284、hsa_circ_0000520、hsa_circ_00019717个。对所筛选出的7个circRNAs在18例检材中进行验证,发现只有hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0005251、hsa_circ_00002845个circRNAs随着死亡时间增加,其相对表达量显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。而hsa_circ_0000520、hsa_circ_00019712个circRNAs的表达为阴性。结论circRNA是一种较为稳定的生物标记物,部分可用于死亡时间推断的研究。     

大鼠弥漫性脑损伤后S100β表达与损伤时间关系

目的探讨大鼠弥漫性脑损伤后S100β在脑组织中不同部位的时间相关性表达,并以此为弥漫性脑损伤时间推断,生前伤和死后伤判断,早期诊断提供实验依据。方法运用免疫组织化学和图像分析技术,检测弥漫性脑损伤后30min和2,4,12,24h及3,7d,死后10min损伤,各组S100β在大脑皮质、海马、丘脑、脑干中神经胶质细胞的表达,并设立正常对照组。结果S100β阳性细胞个数及蛋白表达在皮质、海马、丘脑形成先增后降再升的曲线,即两次表达高峰,脑干表达变化不显著;在伤后2h,海马、丘脑S100β表达细胞个数和蛋白量开始增加,4h有显著增加,12h达到高峰值,皮质部位在4h达到高峰。伤后7d恢复正常值。结论弥漫性脑损伤后S100β在不同部位表达有不同规律性且有较好的时间相关性,可成为法医学脑损伤时间推断的一种有效指标。     

反应动力学推断死亡时间可行性的研究

目的探讨利用反应动力学方法推断死亡时间的可行性。方法15头家猪随机分为3组，每组5头，心内快速注射10%氯化钾溶液将其处死，尸体分别置于5℃、15℃、25℃环境条件下，每分钟测量一次直肠温度，持续30 h，将测得的尸体温度减去设置的环境温度，利用反应动力学方法对温差数据进行计算，通过拟合线性回归方程进行分析。同时利用一级反应动力学方法对Marshall研究的人体尸温数据进行分析，推导出人体死后尸温冷却速率常数及死亡时间计算公式，将公式运用于实际案例，并与Henssge公式进行比较。结果不同实验组，家猪死后尸温与环境温度间温差-ln(C/C₀)的线性决定系数均在0.9以上，接近于1，与时间t呈较好的相关性。人体死后尸温冷却速率常数约为0.068 4，死亡时间推断公式为：-ln{(T_尸体-T_环境)/(37.2-T_环境)}=K{t-(2-3)_平台期}，案例1该公式计算的死亡时间误差小于Henssge公式，案例2该公式计算的死亡时间误差稍大于Henssge公式。结论稳定条件下，家猪死后...     

氰化物急性中毒大鼠的血浆代谢组学研究

目的 利用代谢组学技术研究急性氰化物中毒大鼠血浆中小分子代谢物的变化，寻找差异代谢物，分析与氰化物中毒相关的代谢途径，进而研究氰化物中毒的机制。方法 将健康SD大鼠随机分为空白对照组和实验组（雄性，每组5只），实验组灌胃3.2 mg/kg(1/2LD50)氰化钾溶液建立氰化物急性中毒模型，对照组灌胃等剂纯水，灌胃后分别于45 min,24 h,120 h眼眶静脉采血，通过高效液相色谱-飞行时间质谱采集大鼠血浆代谢谱，根据主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）以及t检验和变异倍数分析筛选差异代谢物，并通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库进行代谢通路分析。结果 筛选出19个与氰化物中毒相关的差异代谢物，且随时间变化差异代谢物的种类存在差异，主要涉及胆汁分泌、氨基酸代谢等共11条代谢通路。结论 可将牛磺胆酸盐和牛磺鹅胆酸盐作为氰化物中毒潜在生物标志物，马尿酸可以作为两者的辅助指标，也可根据差异代谢物的不同进行服药时间的初步推断。氰化物会对机体酶的活性和能量代谢过程产生影响，且可能造成肝脏损伤。