改良TRIzol法同步提取血液RNA和DNA

目的建立一种应用TRIzol试剂针对同一生物检材在提取总RNA的同时又能提取DNA的新方法。方法使用传统TRIzol法将含有总RNA的水相移除,调节中间层和有机相的pH值,乙醇沉淀DNA,运用DNA IQTMsystem试剂盒纯化DNA。检测DNA纯度和质量浓度,并以之为模板进行PCR-STR分型。与传统TRIzol法提取的基因组DNA进行比较。结果改良TRIzol法提取的基因组DNA较传统TRIzol法提取的基因组DNA纯度和质量浓度高,扩增后STR分型良好。结论改良TRIzol法可靠易行,能够实现同一样本同时提取RNA和DNA的目的,可以满足法庭科学个体识别和亲缘鉴定的要求。     

Trizol法大鼠心肌总RNA提取方法探讨

目的 探讨大鼠心肌总RNA的提取方法,为今后法医学研究和实践工作提供参考.方法 用Trizol法,严格注意无RNA酶操作,通过裂解组织,分离、沉淀RNA而提取大鼠心肌总RNA,并用分光光度计、凝胶电泳及RT-PCR检测结果.结果 Trizol法能获得较高纯度和产量的完整总RNA.结论 Trizol法是提取总RNA可靠有效的方法,可望在法医学领域有较广的应用.     

血痕特异性mRNA标记研究

血痕是案发现场尤其是命案中比较常见的生物物证,而血痕的正确组织来源推断是当前鉴定工作中急需解决的问题。随着法医物证学的不断发展,以mRNA(messenger RNA)为基础的体液斑迹组织来源鉴定技术作为一种不同于传统血痕免疫学检测的新型方法,已经越加显示其独特的优越性。在该技术的基础上,实现共同提取生物物证的RNA与DNA的目标,建立体液斑迹鉴定与DNA分型兼容的方法,有利于现场重建,提高生物物证的证据效力,完善证据链。本研究建立了一个包括血痕总RNA提取、逆转录、荧光特异引物扩增、遗传分析仪电泳检测分析等步骤的血痕来源推断技术平台。实验共采集制备了40份的中国人群(女性)外周血、16份月经血样本,筛选了5个外周血标记:HBA、HBB、GYPA、SPTB、ALAS2,2个月经血标记:MMP7、MMP11,构建了一个囊括外周血、月经血特异标记的荧光复合扩增体系。结果显示mRNA技术为基础的鉴定血痕来源的方法是可行的,并且建立了血痕RNA检验的遗传分析仪结果判读方法。     

多手段联合亲子鉴定1例

1案例 某地公安机关送检一案件中可疑父母血样和死者（男性）肋软骨,要求进行亲子鉴定：用Chelex-100法提取可疑父母血样和死者肋软骨DNA．分别用美国AB公司Identifile^TM。试剂盒、Yfile^TM试剂盒和北京基点认知技术有限公司Goldeneye^TM 16BTDNA身份鉴定试剂盒复合扩增,扩增产物用3100遗传分析仪进行电泳分离,得到STR分型结果：     

circRNA应用于体液斑鉴定的技术可行性研究

目的利用circ RNA检测技术,探索circ RNA分子应用于体液斑迹鉴定的可行性。方法制备精液、唾液、阴道分泌物三种体液斑迹样本,以Qiagen RNeasy Micro试剂盒提取总RNA,经RNase R消化后得到circ RNA,进行逆转录PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测分析。结果制备的体液斑迹样本均可检测到circ RNA分子,提示circ RNA普遍存在于法医常见体液斑迹中,具备一定的应用价值。结论 circ RNA的检测可与现有DNA检测技术兼容,利用其组织特异性,可成为体液斑迹鉴定的新标记,具备重要的研究价值。     

X-STR联合常染色体STR用于亲缘关系鉴定1例

1 案例1．1简要案情某年7月27日夜,某乡镇家庭作坊失火。消防救援后,发现3例烧焦炭化的尸体,2例疑似为姐妹,1例疑似为姐姐的儿子．提取各尸体肋软骨和姐妹的父亲鲁某血样要求进行亲缘关系鉴定比对。1．2检验按行业标准GA／T383—2002中Chelex 100法提取基因组DNA,分别用AGCU、X-12、AGCUEx22、AGCU 21＋1（无锡中德美联生物公司）和Identifiler、Sinofiler试剂盒（美国AB公司）,采用10μL体系按照试剂盒说明书进行PCR扩增,扩增产物在3130遗传分析仪（美国AB公司）上毛细管电泳检测,用Gen—eMapperlDv3．2软件进行基因分析。     

男性个体Amelogenin基因座Y片段缺失1例

在法医学实践中．扩增Amelogenin基因是进行生物样本的性别鉴定的主要方法，并为大多数的商品化法医鉴定试剂盒如AmpFlSTR IdentifierTM（ABI）、PowerPlex（Promega）等所采用。但个体的Amelogenin基因如果发生突变，致X或Y特异片段扩增失败，则可能导致错误的性别判定。     

改良EVO150-8方法在DNA自动化检案中的应用

目的探讨改良EVO150-8方法在批量生物检材DNA检验中的应用价值,建立一种自动化、简单、快速的DNA提取方法。方法采用改良EVO150-8自动化核酸提取纯化仪器与DNA IQ磁珠法纯化试剂盒,对各现场提取的880份血迹、烟蒂、口香糖、精斑（混合斑）、组织、骨骼、脱落细胞等常见生物检材进行DNA提取与纯化,采用Identifiler试剂盒进行扩增检验,用3130XL电泳,GeneMapper ID V3.2分析软件进行分析比对。结果在880份生物检材中,有836份检材成功获得STR分型;检验92份检材仅需时128min。结论改良EVO150-8适合批量生物检材的自动化提取。     

骨骼肌circRNA在死亡时间推断中的初步筛选及验证研究

目的通过构建骨骼肌中环状RNA(circular RNA,circRNA)表达谱,筛选出人体骨骼肌中与死亡时间具有时序性变化的circRNAs,并对筛选出的circRNAs进行验证,进而探讨其相对表达量与死亡时间的相关性。方法芯片实验选取2例外界温度、湿度相对一致,已知死亡时间在24 h内的个体,分别于尸检即刻(12 h以内)、3、5、7、10 d各取50 g组织进行总RNA提取,并进行逆转录、探针标记、基因芯片检测等实验,初步得到circRNA表达谱;对筛选出的circRNAs在后续收集的18例检材中进行验证,对所得数据进行统计分析。结果骨骼肌组织中共检测出13156个circRNAs,但在10 d内整体呈下降趋势的circRNAs只有hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0000284、hsa_circ_0000520、hsa_circ_00019717个。对所筛选出的7个circRNAs在18例检材中进行验证,发现只有hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0005251、hsa_circ_00002845个circRNAs随着死亡时间增加,其相对表达量显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。而hsa_circ_0000520、hsa_circ_00019712个circRNAs的表达为阴性。结论circRNA是一种较为稳定的生物标记物,部分可用于死亡时间推断的研究。     

法医学鉴定质量评价与控制研究

目的探讨法医学鉴定质量评价与控制的有效途径。方法根据法医学鉴定的要求，选择评价指标、评价等级以及确定权重指数，应用模糊数学综合评判的方法，对法医学鉴定质量进行评价与控制，并结合实例分析如何应用模糊数学综合评判的方法对法医学鉴定质量进行评价与控制。结果该方法对法医学鉴定质量具有有效的评价与控制。结论模糊数学综合评判可作为法医学鉴定质量评价与控制的有效手段。     

小鼠死后脑RNA降解与死亡时间的相关性

目的 探讨小鼠死后不同时间和温度下脑组织β-actin mRNA、18S rRNA的降解规律与死亡时间的关系.方法 将24只健康成年C57BL/6小鼠随机分为2组,每组12只,断颈法处死后分别置于不同的环境温度中(4℃、37℃),恒定环境湿度为80%.分别于死后即刻和0.5、2、6、24、48h取小鼠脑组织进行总RNA...     

不同死因大鼠心肌内多种RNA相对表达量变化与PMI的关系

目的观察不同死因下大鼠心肌内多种RNA相对表达量随死亡时间（PMI）的变化。方法建立断颈死、窒息死和失血性休克死大鼠模型,提取心肌中总RNA,利用实时荧光定量PCR技术检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde～3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）,β-肌动蛋白（β-actin）、诱导型-氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase。iNOS）、缺氧诱导因子-1（hypoxia-induciblefactor-1,HIF-1）、肿瘤坏死因子-d（tumornecrosisfactor-d,TNF-a）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）tuRNA以及U6微核RNAfU6sreallnuclearRNA。U6snRNA）的循环阈值,观察各指标相对表达量随PMI的变化情况。结果U6snRNA表达稳定,可作为内对照。在死亡早期,CAPDH、HIF-1、iNOS、TNF-d和IL-6的相对表达量在窒息组和失血性休克组比断颈组呈现不同程度的增加,而β-actin在3个组皆呈现相对表达量下降趋势。在死亡晚期,随着RNA的不断降解,相对表达量持续下降。结论死后各RNA相对表达量的特征性变化可为不同死因下的PMI推断提供-定的参考。     

不同温度下大鼠脑组织RNA降解与早期PMI的相关性

目的探讨大鼠脑组织8种RNA指标,在不同温度下的表达水平与早期死亡时间(PMI)的相关性。方法将222只SD大鼠随机分为对照组(死后0 h)和4个实验组,实验组断颈处死后分别置于5℃、15℃、25℃和35℃的环境中,于死后1~24 h内9个时间点提取脑组织RNA,利用实时荧光定量PCR技术检测8种RNA指标(β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9及mi RNA-125b)的表达水平,ge Norm软件选取合适内参,SPSS软件对内参标准化RNA指标进行回归分析,R软件构建推断PMI的数学模型,另选6只已知PMI的SD大鼠予以验证。结果 5S rRNA、miR-9和mi R-125b表达稳定,可作为内参指标。β-actin和GAPDH具有良好的时序性降解规律,在24 h内随PMI延长不断降解。R软件拟合得ΔCt值随PMI和温度变化的数学模型可用以推断PMI。运用β-actin和GAPDH验证模型的平均误差率分别为14.1%和22.2%。结论β-actin和GAPDH表达水平与PMI和环境温度相关性良好。本研究建立的数学模型可为温度变化条件下的早期PMI推断提供参考。     

鼠抗人转铁蛋白抗体轻链与重链可变区基因库的制备

以纯化的人转铁蛋白免疫小鼠,测其血清效价,合乎要求后杀鼠取脾脏并以异硫氰酸胍和酚的混合溶液将其匀浆,再以氯仿抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤,所得总RNA以oligo(dT)纤维素离心柱分离纯化制备mRNA,使mRNA达到eDNA合成所需的浓度后,反转录制备出eDNA,在合成的eDNA中加入轻、重链引物,扩增制备出小鼠抗人转铁蛋白抗体的轻、重链可变区基因库。     

The development of a method for FISH identification of forensically relevant body fluids

Messenger RNA profiling is a useful confirmatory test for body fluid identification, but there are limitations to this method including sensitivity and the difficulty in linking body fluids with the corresponding DNA profile in mixed samples. We have developed a method for RNA suspension fluorescence in situ hybridisation (RNA S-FISH) for forensic-type samples using locked nucleic acid (LNA) probes. Vaginal and buccal epithelial cells have been the primary focus, with some preliminary work performed on leucocytes and seminal round cells. We have designed probes for the KRT10 messenger RNA and the micro RNA 891a. Using these probes, we have optimised a RNA S-FISH methodology and have successfully visualised these cell types using fluorescent microscopy.     

Multivariate analysis for estimating the age of a bloodstain

Our objective is to provide crime laboratories with a technique for estimating the age of a bloodstain. Toward that goal, we have used multiplexed, real-time RT-PCR (or qPCR) to determine the relative stability of different-sized segments of the same RNA species as well as differences in stability between two different RNAs' change over time in bloodstains. Our results indicate that a multivariate analysis of the changing ratio of the different RNA segments can be used to differentiate between samples of different ages in the defined population. Bloodstains from 29 of 30 donors could be partitioned into different ages using this technique. Although further improvements will be required before this approach can be implemented in crime laboratories, the multivariate analysis holds promise of providing a reliable approach for temporally linking a bloodstain to the commission of a crime or excluding a bloodstain as being irrelevant to the case in question.