猪繁殖与呼吸综合征病毒Myanmar株全基因序列的测定与遗传变异分析

2010年首次从缅甸某发病猪场采集的疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and re-spiratory syndrome,PRRS)病料中分离到一株PRRSV,命名为PRRSV Myanmar株。应用RT-PCR方法分段扩增出Myanmar株的各基因片段,并将扩增产物分别连接到pEASY-T3载体并进行测序。序列测定结果表明,Myanmar株基因组全长15 411bp(不包括PolyA尾),包含10个开放阅读框,5′UTR长189nt,3′UTR长151nt。全基因序列与经典PRRSV VR2332株核苷酸序列的一致性为99.3%,与高致病性PRRSV NVDC-JXA1株核苷酸序列的一致性为89.5%。在非结构蛋白Nsp2区域并未出现特征性的30个氨基酸的缺失,而与欧洲型标准毒株(LV)核苷酸序列的一致性为54.6%。上述结果说明Myanmar株在基因型上属于经典美洲型。同时,遗传进化树分析显示,Myanmar株与PRRSV 01NP1.2株、RespMLV株、BJ-4株及PL97-1株的亲缘关系最近。     

口蹄疫病毒Asia 1/JSWX株基因组全长感染性克隆的体外拯救与序列分析

通过反转录聚合酶链反应,获得了口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JSWX株基因组3′端长片段(长约7.5kb)和5′UTR中ploy(C)前后的2个短片段。5′UTR的2个短片段经融合PCR扩增得到长约710bp的片段。用引物在基因组5′末端引入AflⅡ酶切位点和T7启动子,在5′UTR内引入SpeⅠ酶切鉴定位点,在3′末端引入NotⅠ酶切位点,将融合片段和3′端长片段顺次连接到载体pSL1180。经T7体外转录系统获取的RNA转录本与脂质体共转染BHK21细胞。测序结果表明,构建的病毒基因组全长cDNA为8 197nt,分别包括1个长为1 095nt的5′UTR[含有1个17nt的ploy(C)];1个长6 990nt的ORF;1个长为93nt的3′UTR;之后是18nt的poly(A)尾巴。该全长cDNA克隆与Asia 1/Jiangsu/China/2005株基因组序列的同源性为98.4%。测序和酶切鉴定结果均表明,该口蹄疫病毒株全长cDNA克隆已构建成功,该方法极大地简化了获得FMDV全长cDNA克隆的过程。通过反转录聚合酶链反应、间接免疫荧光试验和蚀斑试验等鉴定,本试验获得了感染性分子克隆;体外拯救获得的基因工程病毒连续传代培养后,可致BHK21细胞产生病变。上述结果表明,构建的cDNA克隆可以作为基因操作的载体,为深入研究安全性好、稳定性高和免疫原性强的基因工程疫苗奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒基因1型全基因组的测序分析

以我国新疆地区分离的1株牛源牛病毒性腹泻病毒基因1型毒株为研究对象,参照GenBank中的牛病毒性腹泻病毒1型基因组全序列,根据保守序列设计6对重叠引物,通过RT-PCR扩增出该毒株不同的cDNA片段,分别克隆到pMD19-T载体,转化受体菌JM109,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及测序分析,为了解该毒株的遗传变异及基因结构与生物功能的关系,为开发牛病毒性腹泻病毒新型疫苗奠定基础。测序结果表明,该病毒全基因序列核苷酸为12 302nt(GenBank登录号:JN704144),该病毒基因组具有一个11 694nt开放阅读框编码的多聚蛋白,5′-UTR长382nt,3′-UTR长224nt,BVDV1-3156的全基因组序列分析发现该毒株为BVDV1b亚型。Blast比对分析显示,该毒株与VEDEVAC株的相似性最高,为90.9%。该毒株与BVDV1型其他毒株的全基因组序列具有较大的差异。     

牛肠道病毒北京株的分离鉴定及全基因组分析

采用RT-PCR方法从北京某牛场有腹泻症状牛的粪便样品中检测到牛肠道病毒(bovine enterovirus,BEV),分离出1株病毒并将其命名为BJ101。然后,通过电镜观察、全基因组序列测定和同源性分析,对该毒株进行了验证。结果,BJ101分离株在MDBK细胞上的TCID50为1×10-6.42/0.1 m L,电镜观察到病毒颗粒直径为25~30 nm,无囊膜,呈典型的小RNA病毒粒子形态;BJ101株的基因组长度为7 409 bp,其中5′非编码区(UTR)长812 bp,3′UTR长72 bp,病毒基因组开放阅读框(ORF)全长6 525 bp。对全基因组序列进行比对分析显示,在5′UTR区、编码区和3′UTR区,BJ101分离株与BEV E2型毒株的核苷酸相似性最高。基于VP1基因的系统进化树表明,BJ101株是BEV E2型的成员。上述结果丰富了国内牛肠道病毒的基因库,为BEV的诊断及预防奠定了良好的基础。     

鸭坦布苏病毒AH-F10株全基因组的分子克隆与序列分析

为了解鸭坦布苏病毒安徽分离株AH-F10的分子特征,利用RT-PCR方法对其全基因组序列进行了克隆,并将全基因组及其推导的氨基酸序列与参考毒株进行序列比对及系统进化分析。结果显示,毒株AH-F10的全基因组序列长10 990nt,含有1个大的阅读框架,两侧各有一个非编码区(Untranslation region,UTR)。序列比对结果表明,AH-F10株与13株参考毒株的基因编码区具有较高的氨基酸序列同源性,其中与江苏JS2010株的同源性最高,达98%。研究还发现,鸭坦布苏病毒各分离株的5′UTR的序列表现一定程度的变异,AH-F10株与参考株的核苷酸序列同源性在94%~97%之间。此研究结果为进一步了解鸭坦布苏病毒的遗传变异及构建该病毒的反向遗传学操作系统奠定了基础。     

含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3''''非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列.测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基.经与参考毒株进行序列比较,结果显示, HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%.同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较.结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域.     

含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3′非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较,结果显示,HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%。同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。     

犬瘟热病毒PS株的全基因组序列测定与遗传进化分析

对犬瘟热病毒(CDV)PS株基因组进行全基因组序列测定与分析,以阐明该毒株的基因特征与遗传进化情况。利用RT-PCR方法分段扩增PS株全基因组序列,分别将产物克隆入pMD18-T载体中并进行测序,将所测序列拼接获得CDV PS株的全基因组cDNA。用DNAStar软件比较PS株全基因组序列与国内外犬瘟热病毒疫苗株和野毒株全基因组序列的同源性,然后用Mega4.0软件进行系统进化分析。测序结果显示,PS株全基因组序列的长度为15 690nt,该基因组推导的某些氨基酸位点发生了突变。与GenBank中登录的国内外参考毒株的同源性比较结果显示,PS株基因组与MKY-KM08分离株的基因序列同源性高达97.9%,与其他毒株的同源性为93.0%～97.0%;与CDV3疫苗株和Onderstepoort疫苗株的同源性最低,分别为93.2%和93.0%。基于全基因组序列绘制的系统进化树表明,所有CDV分离株分为疫苗株和野毒株2支,PS株和MKY-KM08株位于同一支,属于亚洲1型。结果表明PS株为野毒株,其全基因组序列与MKY-KM08株的全基因组序列亲缘关系最近。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及其基因组变异特征的研究

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在河南省新乡地区猪体内的进化情况,笔者对河南省新乡地区某猪场送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料进行了病毒的分离鉴定,并采用PCR扩增得到了该病毒的全基因组序列,同时对分离病毒株的GP5和NSP2序列进行了比对分析。结果显示:成功分离并鉴定出1株美洲型PRRSV(XX2015),与中国代表毒株CH-1a中的核苷酸同源性是92.8%,与高致病性(HP)-PRRS病毒代表株Hu N4、Hu B1、He Nan-1、He NAN-A14株的核苷酸同源性则分别为97.2%、97.0%、97.2%、94.4%。对基因组的进一步分析表明,该毒株GP5蛋白非中和性表位处存在氨基酸变异,NSP2蛋白在第481位、第485~488位、第533~561位共缺失34个氨基酸。XX2015分离株是HP-PRRSV的一个代表株,该病毒株在NSP2蛋白中存在跳跃性突变,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子进化提供了分子证据。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。     

猪圆环病毒2型XJ-SW株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采集自新疆沙湾地区某猪场的疑似仔猪多系统衰竭综合征病料猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组进行了扩增,确定了2份病料中的PCV2的分子特征,命名为XJ-SW1、XJ-SW2(Gen-Bank登录号:JN639856,JN639857)。经对阳性样品进行克隆、测定,并应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。结果显示,2株病毒的基因组全长均为1 768nt;XJ-SW1株与我国山东DE株(GenBank登录号:HM142897)的同源性最高(为97.91%);XJ-SW2株与韩国G2284株(GenBank登录号:JF317587)的同源性最高(为97.51%)。PCV2全基因组序列的进化分析表明,2株病毒为PCV2e基因亚型;对2株病毒与5个不同基因亚型的15株病毒的ORF2氨基酸序列进行比较,结果显示,XJ-SW1、XJ-SW2在ORF2的氨基端与PCV2d同源性较高,在羧基端与PCV2e同源性较高。表明,在新疆沙湾猪场流行的PCV2毒株为PCV2e,该毒株的ORF2存在一定变异。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的原核表达及其表达产物的免疫原性

根据GenBank中登录的副猪嗜血杆菌(HPS)D15基因鸟枪序列(登录号:NZ_ABKM01000005)设计1对特异性引物,以HPS5型SP毒株DNA为模板,通过PCR方法扩增了D15基因。将其进行T-A克隆,构建pMD18D15质粒并进行序列测定和分析。结果表明,D15基因含有一个2418bp的开放阅读框,编码805个氨基酸,与D15基因参考序列的同源性为99.9%。该HPSD15基因的推导氨基酸序列具有典型Omp85蛋白家族的拓扑结构特征。以pMD18D15质粒为模板,用PCR方法扩增HPSD15基因,并将其克隆到pET-28a(+)中,构建pETD15原核表达质粒,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导重组菌,并用SDS-PAGE和Western-blot检测诱导物。结果表明,pETD15重组表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白的分子质量约为94ku,融合蛋白能被HPS阳性血清识别,提示该融合蛋白具有反应原性。昆明小鼠和豚鼠免疫试验结果表明,D15重组蛋白具有一定的诱导免疫保护反应的能力。     

广西区2008-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的遗传变异分析

为了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,对2008-2011年间来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2基因的扩增和测序分析。结果显示,获得的49个毒株均为美洲型,其中46株具有高致病性变异毒株的序列特征,即其Nsp2蛋白缺失第481位和第533～561位aa,其余3株不具有上述缺失,属于PRRSV传统毒株。广西区49个毒株Nsp2基因间核苷酸序列的同源性介于84.8%～99.7%,与VR-2332、CH-1a、HB-1及JXA1株核苷酸序列的同源性分别为80.5%～83.7%、89.7%～92.6%、92.4%～96.3%、92.8%～99.3%,而与LV株核苷酸序列同源性仅为51.0%～53.9%。基于Nsp2基因核苷酸序列所绘制的遗传进化树,可将所有美洲型PRRSV毒株分为4个亚群,广西区的49个毒株有3株分布在以HB-1株为代表的Ⅲ亚群,46株分布在以JXA1株为代表的Ⅳ亚群。表明,当前广西区PRRSV流行毒株均为美洲型毒株,并且以Ⅳ亚群为优势基因亚群,各毒株间的Nsp2基因序列存在一定的差异,但没有明显的地域特征。     

鸭黄病毒AH01株的分离与鉴定

为查明2010年10月以来安徽望江等地的蛋鸭相继暴发的以产蛋量大幅下降为特征的传染病的病因,进行了病毒分离、特异性目的基因片段扩增和动物回归试验。结果显示,分离毒(命名为AH01株)能致死鸭胚和鸡胚,不具有血凝性。对病料和接毒鸭胚尿囊液进行RT-PCR,可扩增出基因片段,其核苷酸序列与鸭黄病毒BYD-1株的相似性为94.1%。用鸭胚分离毒接种300日龄蛋鸭,能够复制出产蛋量下降病例。分析表明,分离毒为鸭黄病毒,该病毒是引起此次鸭病疫情的病原。     

山羊关节炎-脑炎病毒陕西分离株全基因组的克隆和序列分析

为了解山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)陕西分离株全基因组的特点及基因演化变化,根据Gen-Bank中登录的CAEV CO株的全基因组序列,设计合成了5对引物,对CAEV陕西株的全基因组进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果显示,CAEV陕西株的基因组全长为9 065nt,获得的GenBank登录号为GU120138,包括两端的长末端重复序列,结构蛋白编码基因gag、pol、env和调节蛋白编码基因tat和rev,以及辅助蛋白编码基因vif。核苷酸序列比对表明,CAEV陕西株和CAEV甘肃株的同源性为99.6%,与CAEV CO株的同源性为92.4%,根据全基因组序列和gag基因序列构建的遗传进化分析结果显示,CAEV陕西分离株属于SRLV B2亚型。     

猪细小病毒YK株NS1基因的克隆与序列分析

提取猪细小病毒(PPV)YK株基因组DNA,利用PCR技术扩增得到了NS1基因全序列,将其克隆到pMD18-T质粒载体并进行了序列测定和分析。结果表明,NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸。氨基酸序列中含有在PPV复制过程中起重要作用的保守基序GKRN,并有3个潜在的糖基化位点NISN、NFSN和NLTR。PPVYK株的NS1基因与其他PPV毒株NADL-2(4973)株、NADL-2(5075)株、NADL-2(5034)株和Kresse株相比,核苷酸同源性分别为98.3%、99.9%、99.9%和99.7%,氨基酸同源性分别为99.7%、99.7%、99.7%和97.7%。结果说明,NS1基因具有高度保守性。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了 1对PCR引物 ,以伪狂犬病病毒Ea株 (pseudorabiesvirusEa ,PRVEa)基因组DNA为模板 ,扩增出一大小为 5 11bp的片段。通过酶切和测序证实 ,该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因 ,即gL基因。Blast软件分析表明 ,该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为 94% ,氨基酸序列的同源性为 95 %。将测序结果输入GenBank ,获得登录号AF44 845 6。