猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。     

蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立检测蓝舌病病毒(BTV)和流行性出血病病毒(EHDV)的快速诊断方法,笔者根据BTV的第10基因节段(Seg-10)和EHDV的第5基因节段(Seg-5)序列,分别设计BTV与EHDV的特异性引物和TaqMan探针,经过反应条件优化,建立了同时检测两种病毒的双重荧光定量RT-PCR方法,并进行了特异性、灵敏度、重复性和临床样品检测验证。用该方法对BTV Seg-10和EHDV Seg-5节段的体外转录ssRNA为模板绘制标准曲线,相关系数(R~2)均大于0.995,线性关系较好;该方法可检测不同血清型的BTV和EHDV,与阿卡斑病病毒(AKAV)、中山病病毒(CHUV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)和牛流行热病毒(BEFV)无交叉反应,表明该方法特异性强;对2种标准品的检出极限均为10 copies/uL,比常规RT-PCR敏感性高10倍;组内和组间重复试验的变异系数均小于2%;用所建立的双重荧光定量RT-PCR方法及常规RT-PCR方法,对100份血液样品和50份病毒液分别进行检测,符合率均大于90%。以上结果表明所建立的双重荧光定量RT-PCR方法具有快速、准确、敏感和稳定等优点,为BTV和EHDV感染的早期快速诊断、高通量检测及流行病学调查提供了有效的技术方法。     

猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪嵴病毒3D基因保守序列设计引物和Taq Man探计,通过优化反应体系,建立了猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性评价;同时以10倍梯度稀释的质粒标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,构建定量分析模型。结果显示,建立的方法能特异性检测猪嵴病毒,与其他引起猪腹泻的病毒无交叉反应,对标准品的检测灵敏度达10 copies/L;标准曲线Ct值和模板终浓度在107~10 copies/L范围内有良好的线性关系;重复性试验变异系数均小于2.5%。对139份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR阳性检出率为30.94%(43/139),常规RT-PCR为29.50%(41/139)。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪嵴病毒的快速检测和流行病学调查。     

猪流感病毒M2多肽抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测猪流感病毒抗体的血清学方法,利用合成的甲型流感病毒M2蛋白多肽作为包被抗原,建立了检测猪流感病毒血清抗体的间接ELISA,并对各种检测条件进行了优化。结果显示,优化后确定的抗原最适包被量为250ng/孔,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶4 000。在优化条件下,阴阳性临界值的判定标准为0.249。用建立的间接ELISA对CSFV、PRRSV、PCV2、PPV、PRV、FMDV、JEV阳性血清进行了检测,均无交叉反应。用该方法对280份冬季采集的猪血清样品进行检测,有60份样品呈现阳性;同时用IDEXX甲型流感病毒抗体检测试剂盒进行平行检测,有61份样品呈现阳性,两者的符合率达到98.35%。结果表明,建立的ELISA具有良好的敏感性、特异性和可信度。本研究为猪流感的诊断和流行病学调查提供了一种准确、快速、简便的方法。     

通用型猪流感病毒PCR-DHPLC检测方法的建立

应用PCR技术结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立通用型猪流感病毒的快速筛检方法。查找、分析猪流感病毒M基因的保守区,设计了1对特异性引物。RT-PCR扩增后经变性高效液相色谱技术分析研究方法的特异性、敏感性和应用性。DHPLC法能特异性检出H1N1、H5N1和H3N2亚型猪流感病毒,与猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型无交叉反应。对构建的含有M基因的重组质粒,该方法的检出下限为100copies核酸。对210份存档猪流感鼻拭子样品,DHPLC法与商业化定量PCR的检测结果完全一致。DHPLC技术为临床大批量猪流感样品的监测提供了一种新的、自动化、高通量的核酸分析平台。     

猪圆环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

为了建立一种定量检测猪圆环病毒1型(PCV1)的实时荧光定量PCR方法,根据PCV1基因序列设计了1对特异性引物,并构建含有PCV1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测PCV1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法的标准曲线的决定系数为0.999,显示出优良的线性关系;最低可准确检测320copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%;该方法对PCV2、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等的检测结果均为阴性;对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于PCV1的检测与定量分析。     

猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗株荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据伪狂犬病病毒gD、gE基因序列设计2对引物及其对应的探针,通过对引物、探针浓度的优化,建立了猪伪狂犬病病毒野毒和减毒活疫苗株荧光定量PCR检测鉴别方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪博卡病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均无扩增曲线。野毒株均出现gD和gE基因扩增曲线,而疫苗株只出现了gD基因扩增曲线,表明该检测方法具有良好的特异性。建立的gD和gE基因标准曲线Ct值和模板终浓度在1×108～1×10 copies/μL范围内均具有良好的线性关系,灵敏度均可达1×10 copies/μL。对39份猪组织样品进行检测,荧光定量PCR检出5份样品猪伪狂犬病病毒gD、gE阳性,表明这5份猪组织样品为猪伪狂犬病病毒野毒感染。常规PCR检出5份猪伪狂犬病病毒阳性,经测序为野毒感染,2种方法符合率为100%。本研究建立的荧光定量PCR可用于猪伪狂犬病病毒的快速检测和流行病学调查。     

禽呼肠孤病毒纳米PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感的禽呼肠孤病毒(ARV)检测方法,针对ARV S3基因的保守区域设计1对特异性引物,建立了ARV纳米PCR检测方法。结果显示,该方法特异性好,仅从ARV核酸样品可检测到约332 bp的特异性目的条带,而对新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒、鸡毒支原体、马立克病病毒、传染性喉气管炎病毒、鸭瘟病毒、禽腺病毒Ⅳ型、减蛋综合征病毒、H9亚型禽流感病毒和鸡大肠杆菌等其他病原的检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该纳米PCR方法能检测到的最低核酸质量浓度为56 pg/L,其灵敏度是普通PCR的10倍。ARV核酸被重复检测3次,结果均一致。应用建立的纳米PCR和病毒分离鉴定方法对临床送检的30份样品进行检测,两种方法的符合率为100%。以上结果表明,成功建立了ARV的纳米PCR检测方法,具有更高的敏感性和良好的特异性,可用于ARV感染的临床诊断及流行病学调查。     

猪环曲病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪环曲病毒N基因保守序列设计特异性引物与TaqMan探针,建立猪环曲病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法能检测猪环曲病毒,而对猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪星状病毒、A群猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪嵴病毒和伪犬病病毒等核酸的检测均无交叉反应,具有良好的特异性;建立的定量标准曲线Ct值和模板终浓度在109~102copies/L范围内有良好的线性关系,该方法检测灵敏度可达102copies/L;重复性试验的组内、组间的变异系数均小于2.5%。对88份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR检出30份猪环曲病毒阳性,常规RT-PCR检出28份猪环曲病毒阳性,两种方法的符合率为93.34%。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪环曲病毒的快速检测和流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典毒株的序列差异,分别设计了1对特异性鉴别引物和1条TaqMan探针,建立了检测PRRSV变异株的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,建立的方法可鉴别诊断PRRSV变异株和经典毒株,具有较高的特异性;可以检测相当于1TCID50的病毒模板,比常规RT-PCR方法的灵敏度高100倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<10%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对13份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出11份阳性,高于常规RT-PCR方法。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法能检测高致病性PRRSV变异株,不仅特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于变异PRRSV的临床诊断和流行病学调查。     

H1N1和H3N2亚型流感病毒基因芯片检测方法的建立

为建立同时能鉴别甲型H1N1和猪流感病毒常见亚型的新型基因芯片检测方法,根据GenBank中已发表的甲型流感病毒MP的基因序列和甲型H1N1(2009)和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型的基因序列,设计、筛选并合成7对特异性引物和1对通用引物;根据扩增的靶序列,设计并合成14条特异性探针和3条质控探针,制备了甲型H1N1(2009)流感病毒和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型基因芯片;并进行了特异性试验、敏感性试验和田间样品的检测。结果显示,该芯片检测方法与猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病毒无交叉反应;对猪H1N1、猪H3N2和甲型H1N1(2009)流感病毒而言,最低可检测到105、104和105稀释的病毒株。结果证实,该方法特异性强、敏感性高,是一种高通量的甲型H1N1和猪流感常见亚型筛查方法。     

猪伪狂犬病病毒环介导等温扩增检测方法的建立

针对猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计并合成了4条引物,建立了伪狂犬病病毒的环介导等温扩增检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性地检测猪伪狂犬病病毒强毒株,不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株;该方法的最低检测量可达100个拷贝质粒DNA,比常规PCR方法的敏感性高10倍。试验表明建立的环介导等温扩增方法具有较高的特异性、敏感性和可重复性,可用于伪狂犬病病毒的快速诊断。     

A型H1N1及H3N2亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

根据A型H1N1亚型流感病毒2009年北美变异株和H3N2亚型流行株的基因序列,设计了3套特异性引物、TaqMan探针,分别用不同的荧光基团标记,以构建的A型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒基因重组质粒作为阳性对照,经反应条件优化,特异性、敏感性和重复性试验,筛选出3套不同的反应体系及同一个反应参数,建立了可同时检测A型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法。结果表明,该方法可特异地检测H1N1(人源、猪源)、H3N2(猪源),禽流感病毒H5、H9等A型流感病毒,且与新城疫病毒、减蛋综合征病毒等其他病毒不发生交叉反应,具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点,试验耗时仅3h。表明,建立的方法,一次试验即可完成A型流感病毒的初筛和H1N1、H3N2亚型流感病毒的初步确认定型。     

高致病性H7N9流感病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

2017年初在中国出现的H7N9流感病毒变异株表现出对禽高致病性的特征,根据高致病性H7N9流感病毒(HP-H7N9)的HA基因序列,设计1组HP-H7N9特异性的引物和探针,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性、敏感性和重复性试验,制作了标准曲线。结果显示,本方法只对HP-H7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到35.45 copies的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法的建立将为HP-H7N9的诊断、监测和防控提供快速、特异、敏感的技术手段。     

副溶血性弧菌LUXTM荧光PCR快速检测方法的建立

根据LUXTM荧光PCR技术原理,针对副溶血性弧菌toxR基因的保守序列,设计了特异的LUXTM荧光标记引物,通过优化反应条件与参数,建立了可快速检测副溶血性弧菌的LUXTM荧光PCR方法。结果显示,该方法高度敏感,对纯菌的检测低限达到每个反应体系7个菌(CFU),经6 h增菌培养后检测,对样品的检测低限(CFU)达到100/25 g;特异性强,对副溶血性弧菌2株标准菌株和10株参考菌株的检验均呈阳性,而对霍乱弧菌等28株非目标菌的检测均呈阴性;重复性好,定量检测的批内和批间变异系数均小于1%。应用此方法检测水产样品103份,检出阳性样品6份,与TaqMan荧光PCR和SN标准的检测结果完全一致。用此方法可在8 h内完成对样品中副溶血性弧菌的检测,其检测的快速性、敏感性和特异性与TaqMan荧光PCR技术相当,但检测成本更低。     

H3N2亚型猪流感病毒核蛋白基因的优化表达及抗原性分析

根据已获得的猪流感病毒(SIV)分离株A/Swine/Guangdong/9/05(H3N2)NP基因的核苷酸序列设计合成了1对带有特定酶切位点的引物,经RT-PCR扩增NP基因,将其克隆到pMD19-Simple-T载体,鉴定并测序正确后,构建pET32a-NP表达质粒,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为73ku,在25℃条件下主要以可溶性形式存在。将重组NP蛋白纯化后进行Western-blotting和间接免疫荧光试验,结果显示,表达蛋白可分别与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有良好的反应原性和交叉反应性;用纯化的重组NP蛋白免疫小鼠制备的多克隆血清也可与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV发生特异性反应,进一步证实所表达的重组NP蛋白具有良好的免疫原性。     

H3亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA检测方法的建立

根据GenBank上登录的H3亚型猪流感病毒HA基因序列设计了1对引物,经PCR扩增出HA基因目的片段,并将其克隆到pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67C-H3,转化至含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-H3,在脂质体介导下转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-H3,将其感染sf9昆虫细胞,收获目的蛋白。经血凝试验、SDS-PAGE、Western-blot、免疫组织化学分析,结果表明,HA蛋白得到表达,且具有良好的免疫学活性。用表达的HA蛋白作为包被抗原,初步建立了H3亚型猪流感病毒的间接ELISA检测方法,通过对93份送检的疑似猪流感血清进行检测,结果显示,检出阳性率为46.24%。上述结果为建立快速、准确、简便的H3亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank上登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)株的ORF3基因序列保守型片段设计特异性引物,建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。在4.32×102～4.22×107copies范围内,它有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异峰,无引物二聚体,熔解温度为82.23℃±0.19℃。它对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,表明其特异性强。该方法的组内变异系数为0.05%～0.87%,组间变异系数为0.32%～1.24%,重复性好。结果表明,建立的SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR为PEDV早期感染的诊断及定量分析提供了新的方法。     

屠宰猪肝和血清中乙型肝炎病毒及戊型肝炎病毒的检测

应用1对乙型肝炎病毒(HBV)S基因保守区的引物,采用PCR方法从屠宰猪肝、血清中检测到了HBV,序列分析表明,扩增片段与已发表的HBV S基因的同源性高达98%~100%。电镜负染色样品观察结果表明,在HBV表面抗原ELISA检测强阳性反应的血清样品中存在有形态、大小与人HBV Dane颗粒和小球状颗粒相似的病毒粒子。针对戊型肝炎病毒(HEV)ORF2/ORF3重叠区设计了简并引物,采用巢式RT-PCR对屠宰猪肝和血清样品进行了检测。结果表明,部分屠宰猪肝中存在HEV。