H1N1和H3N2亚型流感病毒基因芯片检测方法的建立

为建立同时能鉴别甲型H1N1和猪流感病毒常见亚型的新型基因芯片检测方法,根据GenBank中已发表的甲型流感病毒MP的基因序列和甲型H1N1(2009)和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型的基因序列,设计、筛选并合成7对特异性引物和1对通用引物;根据扩增的靶序列,设计并合成14条特异性探针和3条质控探针,制备了甲型H1N1(2009)流感病毒和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型基因芯片;并进行了特异性试验、敏感性试验和田间样品的检测。结果显示,该芯片检测方法与猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病毒无交叉反应;对猪H1N1、猪H3N2和甲型H1N1(2009)流感病毒而言,最低可检测到105、104和105稀释的病毒株。结果证实,该方法特异性强、敏感性高,是一种高通量的甲型H1N1和猪流感常见亚型筛查方法。     

A型H1N1及H3N2亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

根据A型H1N1亚型流感病毒2009年北美变异株和H3N2亚型流行株的基因序列,设计了3套特异性引物、TaqMan探针,分别用不同的荧光基团标记,以构建的A型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒基因重组质粒作为阳性对照,经反应条件优化,特异性、敏感性和重复性试验,筛选出3套不同的反应体系及同一个反应参数,建立了可同时检测A型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法。结果表明,该方法可特异地检测H1N1(人源、猪源)、H3N2(猪源),禽流感病毒H5、H9等A型流感病毒,且与新城疫病毒、减蛋综合征病毒等其他病毒不发生交叉反应,具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点,试验耗时仅3h。表明,建立的方法,一次试验即可完成A型流感病毒的初筛和H1N1、H3N2亚型流感病毒的初步确认定型。     

H7N9亚型禽流感病毒HRM检测方法的建立

根据H 7N 9亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因保守区域,分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了基于高分辨率熔解曲线(HRM)分析的H7N9亚型AIV检测方法。结果显示,该方法特异性强,其他常见禽源病毒及非H7亚型和非N9亚型的AIV不能形成特异熔解峰形;灵敏度高,对H7和N9阳性质粒的最低检测限分别达到1.0×101 copies/L和1.0×100 copies/L;重复性好,熔解峰Tm 1和Tm2的批内和批间变异系数均1%;临床样本检测与某商品化H7N9亚型AIV定量PCR检测试剂盒比较,符合率为100%。该方法可用于临床疑似病例的应急检测、早期诊断及养鸡场、活禽交易市场等外环境H7N9亚型AIV的监测。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒液相芯片检测方法的建立

为应用液相芯片技术建立同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,在GenBank中收集H5、H7、H9亚型AIV的HA基因序列,利用DNAMAN软件分析比较筛选出特异的保守片段,设计引物和探针。将多重不对称RT-PCR扩增产物与偶联荧光微球的探针进行杂交,建立多重液相芯片方法。结果显示,多重液相芯片技术对H5、H7、H9亚型AIV核酸的最低检出量分别为18.5、28.7、20.7pg/μL,检测的特异性和重复性都很好,应用该方法和禽流感检测试剂盒双盲试验同时对50份已知病毒的样品进行了检测,两者符合率为100%。该方法为禽流感病毒核酸液相芯片的进一步研究奠定了基础。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS基因的克隆及序列分析

采用RT PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示,分离毒株间的核苷酸同源率为90.2%～98.7%,氨基酸同源率为82.6%～97.8%。与其他毒株比较A Goose HLJ P46 2003(H5N1)和A Goose HLJ G2 2003(H5N1)株NS基因在第264～278位处发生了15个核苷酸缺失;A Goose Jilin W2 2004(H5N1)株NS1基因蛋白编码区的第652位碱基发生T C突变,成为终止密码子,造成NS1蛋白的C末端有13个氨基酸缺失。证实不同基因型的H5N1亚型禽流感病毒在我国家禽中同时存在;H9与H5亚型流感病毒基因间存在着广泛的遗传交换。     

禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的建立

研究建立了禽流感病毒(AIV)A型、H5、N1、H9、N2亚型特异性RT-PCR及H5/N1、H9/N2、A/H5/N1多重RT-PCR检测技术,用于检测或同时检测和鉴别A型及H5N1、H9N2亚型AIV。所建立的RT-PCR和多重RT-PCR从核酸提取、基因扩增到产物分析在3~4h内即可完成,经对36株AIV及相关病毒分离物检测,与病毒分离鉴定的结果完全一致,且与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用多重RT-PCR检测80份棉拭子样品,并与病毒分离鉴定方法比较,二者H5N1、H9N2亚型的鉴定结果完全吻合。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为临诊样品中AIV型及H5N1、H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。     

H5N1和H9N2亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的建立

采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体,研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。优化了反应条件,确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性进行了分析,并与病毒分离鉴定的结果进行了比较。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。     

禽流感病毒N1和N2亚型神经氨酸酶RT-PCR鉴别方法的建立

针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的禽流感病毒(AIV)N1、N2亚型神经氨酸酶基因设计了2对引物,建立了一种RT-PCR鉴别方法,其目的片段大小分别为358 bp、377 bp.经对A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/Turkey/England/N28/73(H5N2)、A/African starling/983/79(H7N1)和A/Turkey/Wiscosin/1/66(H9N2)病毒株的鸡胚尿囊液样品进行扩增,扩增片段的大小与预期大小完全相符.经对国内不同地区分离的16株AIV N1亚型和21株AIV N2亚型用RT-PCR方法检测,阳性检出率分别为87.5%(14/16)和95.2%(20/21);对50份样品进行盲检,准确率为98%(49/50).     

H11亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种特异、灵敏和快速的H11亚型禽流感病毒(AIV)RT-LAMP可视化检测方法。根据H11亚型AIV HA基因保守序列,设计6条特异性引物,优化反应条件,进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果显示,该方法只能扩增H11亚型AIV,不与其他亚型AIV和禽病病原体发生交叉反应,表明该方法特异性强;对H11亚型AIV RNA的检测下限为10fg,表明该方法敏感性高;在63℃等温条件下作用1h即可完成全部扩增反应;对206份临床样品的检测结果与病毒分离一致。结果表明,本研究中建立的H11-RT-LAMP检测方法具有简便、快速和结果可视化的优点,尤其适合在基层兽医站和养殖场进行快速检测,具有非常广阔的应用前景。     

H5N1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中,构建重组转移载体pSY(NA+LacZ),将其转染鸡胚成纤维细胞,经蓝白斑筛选,纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA,用其免疫SPF鸡,检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示,该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白,表达产物的分子质量约为55 ku;用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后,能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明,重组禽痘病毒rFPV-NA具有良好的免疫原性。     

H9N2亚型猪流感病毒A/Swine/Shandong/1/02 分离株的基因序列分析

从有肺炎症状的病猪中分离到1株H9N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Shndong/1/02,对其进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因片段的核苷酸序列均来自禽流感病毒(AIV),与我国目前家禽中流行的H9N2亚型AIV毒株具有很高的同源性,与A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)的同源性为94.1%～98.9%,与A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)的同源性为94.5%～98.2%;推导的其血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为P-A-R-S-S-R,完全符合H9亚型AIV欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/1/94亚分支的特征;基因分析结果表明,该分离株的所有基因片段均来源于H9N2亚型AIV,它可直接感染猪,并导致发病,但它并未在猪体内发生重组.     

禽流感重组禽痘病毒疫苗不同途径及剂量接种的免疫效力

将表达禽流感病毒 (AIV)H5HA和N1NA基因的重组禽痘病毒 (rFPV HA NA)以不同剂量分别经翅下刺种、肌肉注射、皮下注射、点眼及滴鼻途径接种于 4周龄SPF鸡。结果 ,该疫苗经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种的SPF鸡 ,能够诱导其产生血凝抑制 (HI)抗体 ;用10 0LD50 的HPAIVA/Goose/Guangdong/ 1/ 96 (H5N1)毒株攻击后 ,免疫鸡无一发病和死亡 ,免疫保护率为 10 0 %。以点眼和滴鼻途径免疫的SPF鸡 ,大剂量接种能够诱导产生一定水平的抗体 ,攻毒后的保护率分别为 83.3%、6 6 .7% ;而小剂量接种则不产生免疫反应 ,保护率为 0。表明rFPV HA NA疫苗只有经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种 ,才能够诱导机体产生高水平的免疫力。     

三株鸭源H9N2亚型禽流感病毒福建株全基因的测序及遗传进化分析

为明确3株鸭源H9N2亚型禽流感病毒福建株A/Muscovy duck/Fujian/CL/1997(H9N2)(简称CL株)、A/duck/Fujian/MH/2003(H9N2)(简称MH株)和A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)(简称FQ2株)全基因组的分子特征和遗传进化情况,采用RT-PCR方法扩增这3株病毒全基因片段,并进行序列比较及遗传进化分析。结果表明,所克隆的8个基因片段均有完整的开放阅读框,其血凝素基因蛋白裂解位点的氨基酸组成为-RSSR*GLF-,为不连续的碱性氨基酸,其静脉接种指数远小于1.2,均符合低致病性AIVHA蛋白裂解位点特征;CL株和MH株的HA基因在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94群系;FQ2株HA基因在遗传进化上属于DK/HK/Y280/97群系,3株H9N2亚型AIV HA基因在遗传进化上均属于经典的欧亚种系。3株H9N2亚型AIV NA基因颈部均存在缺失,CL株和MH株的NA基因在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94群系,FQ2株NA基因在遗传进化上属于G1群系。CL株和MH株的其他6个基因在遗传进化上均和经典的CK/BJ/1/94一致,而FQ2株则可能是由不同流感病毒基因亚系间发生自然重排的产物。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

鸭H5N1型高致病性禽流感的病理组织学观察

对发生H5N1型高致病性禽流感鸭场的鸭进行了病理组织学观察。结果显示 ,该养鸭场患鸭禽流感病鸭的剖检变化以眼结膜潮红出血 ,心肌白色条纹状坏死、条带样出血 ,胰腺有白色或透明坏死点 ,胃肠出血等为特征。组织学以非化脓性脑炎、胰腺坏死、心肌坏死、坏死性脾炎的病理变化为主。     

H5亚型禽流感病毒HA1基因在Sf9昆虫细胞中的表达及其抗原性检测

利用pBlueBacHis2杆状病毒载体在昆虫细胞Sf9中表达H5亚型禽流感病毒(AIV)的 HA1基因。Western-blotting证明HA1在昆虫细胞中得到了表达,其产物具有抗原性;且不与 H7、H9 AIV的抗血清发生交叉反应,具有良好的特异性。Dot-ELISA结果显示,表达蛋白可以在非变性条件下与相应抗体作用,同样具有良好的抗原性。试验结果证明,表达的H5亚型AIV的 HA1蛋白,为检测禽类体内是否感染H5亚型AIV和监测免疫禽类血清H5抗体水平提供了优良的检测抗原。