牦牛IFN-γ基因的表达及其产物的生物学活性分析

用植物血凝素和脂多糖诱导牦牛外周血淋巴细胞,提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术克隆了牦牛IFN-γ(YakIFN-γ)基因,然后设计了1对表达引物,从pGEM-YakIFN-γ载体上扩增YakIFN-γ成熟蛋白基因,将牦牛IFN-γ基因与表达载体pET-30a连接,构建了重组表达质粒pET-30-YakIFN-γ。用IPTG诱导表达的可溶性表达产物经镍柱亲和纯化,用纯化的重组YakIFN-γ蛋白进行了MTT、抑制肿瘤细胞增殖和细胞病变抑制的生物学特性研究。结果显示,成功克隆和表达了YakIFN-γ基因;序列分析表明:克隆的YakIFN-γ基因序列与GenBank上登录的黄牛IFN-γ基因序列的同源性为99.0%。SDS-PAGE分析和Western-blot检测证实,获得了高纯度的重组YakIFN-γ蛋白。重组YakIFN-γ(rYakIFN-γ)对伪狂犬病病毒的活性单位为2.2×103U/mg。表明表达并纯化的rYakIFN-γ蛋白具有较高的生物学活性和干扰病毒复制的活性。     

惠阳胡须鸡Ⅱ型干扰素基因在毕赤酵母中的表达及其产物活性分析

为了确定惠阳胡须鸡IFN-γ基因(chIFN-γ2)在毕赤酵母中表达的重组蛋白的抗病毒活性和蛋白的二级结构,将pGEM-T-chIFN-γ2重组质粒中的chIFN-γ2基因克隆到表达质粒pPICZαB上,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后的序列同源性分析,证明目的基因没有发生缺失、突变,并且插入方向正确。将重组质粒电转化到毕赤酵母感受态细胞GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达。重组IFN-γ的分子质量约为33 ku,表达量达0.604 mg/mL,在鸡胚成纤维细胞(CEF)上抑制VSV的抗病毒活性为3.2×104U/mg。圆二色性分析表明,IFN-γ酵母重组蛋白属于典型的α螺旋蛋白,二级结构含量为:α螺旋55.1%,β折叠8.3%,转角13.9%,无规卷曲22.8%。采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-γ,并首次证明鸡IFN-γ重组蛋白属于典型的α型蛋白。     

微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因的克隆与原核表达

提取微小隐孢子虫鼠基因型卵囊总RNA,用RT-PCR扩增微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因并克隆到pMD18-T载体中.将鉴定正确的序列亚克隆于原核表达载体pET-28b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫动物后检测血清抗体.结果显示,克隆的目的基因核苷酸序列与GenBank登录的序列的同源性为98.66%.目的基因在大肠杆菌中以可溶形式高效表达.表达的重组蛋白占菌体可溶性总蛋白的57.5%,纯化的重组蛋白纯度达95.2%.重组蛋白可被兔抗微小隐孢子虫血清特异性识别,用重组蛋白免疫3次后,兔血清特异性抗体达到较高水平.表明,该重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性.     

鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK和鸡IFN-γ重组质粒的构建与体外表达

采用SOE-PCR技术将鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK抗原基因与鸡干扰素-γ(IFN-γ)基因用(GGGGS)315个疏水柔性氨基酸接头融合,扩增出IFN-γ-CDPK融合基因,将其克隆到pMAL-p2X载体上,构建了重组原核表达质粒pMAL-IFN-γ-CDPK,用IPTG诱导表达并纯化重组蛋白,经免疫印迹分析该蛋白的生物学活性。结果显示,成功构建了共表达IFN-γ-CDPK融合基因的原核表达载体,表达纯化了具有良好的免疫反应性的IFN-γ-CDPK融合蛋白,表达纯化的IFN-γ-CDPK融合蛋白能够和鸡柔嫩艾美耳球虫甘肃株抗血清发生特异性结合,为进一步研制高效力的鸡球虫新型基因工程疫苗奠定了基础。     

猪IFN-α1基因的原核表达及其蛋白质结构的预测

利用RT-PCR技术,从被诱导的猪外周血单核细胞中克隆出了猪α1干扰素(IFN-α1)基因.序列分析表明,克隆的猪IFN-α1基因序列与GenBank上登录的猪IFN-α1基因的同源性为97.8%.用克隆的猪IFN-α1基因构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-IFN-α1.探讨了猪IFN-α1.基因表达的最佳条件,并在大肠杆菌中对此基因进行了表达.结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为42℃,诱导9h表达量最大,表达产物约占菌体总蛋白的30%.SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子质量为45 ku,且目的蛋白主要以包涵体的形式存在.经预测,猪IFN-α1蛋白为一结构松散的球状蛋白.     

大通牦牛LF基因的克隆与分子特征

通过RT-PCR克隆了牦牛包含LF基因编码区的cDNA序列(GenBank登录号为EU547251);将克隆获得的LF基因的cDNA与乳牛相应序列进行了比对;对牦牛LF蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号为ACB29794)与其他物种的相应序列进行了比较,应用在线生物软件对牦牛LF蛋白的特性和结构进行了预测.结果表明,克隆获得的牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124bp,编码708个氨基酸;克隆获得的牦牛cDNA序列与乳牛该序列存在15个碱基的变异;各物种LF蛋白具有较高的同源性,LF蛋白进化树符合物种进化规律;牦牛LF蛋白含有α-螺旋36.0%、β-折叠22.4%、β-转角31.1%、无规卷曲12.9%;同源建模预测的LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成的2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由一段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈"二枚银杏叶型"结构.     

赤羽病病毒N基因硫氧还蛋白融合表达载体的构建与表达

为获得赤羽病病毒 (Akabanevirus ,AKAV )的核蛋白重组抗原 ,根据其基因序列(SmRNA)设计合成了 1对特异性引物 ,对AKAVN基因进行RT PCR扩增 ,产物大小约为 6 96bp ,回收纯化后 ,将其克隆至 pMD18 T质粒载体中 ,经核苷酸序列分析 ,与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的SmRNA基因比较后发现 ,所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达 98.3% ,推测的氨基酸同源性为 97.6 % ,证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体 ,转化TOP10细胞 ,成功地构建了AKAVN基因重组表达载体。经L araboinose诱导表达 ,可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白 ,分子质量约 4 2 .5ku ,其表达产量约占菌体总蛋白的 2 8% ,融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原 ,可作为ELISA包被抗原     

杜氏利什曼原虫NH36基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

应用RT-PCR技术扩增并克隆杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)NH36编码基因,经鉴定及序列分析,构建其原核重组表达载体,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting鉴定其表达产物。结果显示,获得的NH36开放阅读框为945 bp,编码314个氨基酸残基,与GenBank上发表的国际标准株NH36编码基因序列以及氨基酸序列同源性分别为88.57%(837/945)和89.17%(280/314)。表达蛋白为36 ku,经1 mol/L IPTG诱导6 h后的表达量最高;薄层扫描显示表达的蛋白占菌体蛋白总量的57%;该蛋白可被抗杜氏利什曼原虫的多克隆抗体血清识别。     

长毛兔和獭兔IFN-γ基因的克隆与真核表达及表达产物的生物学活性

为扩增长毛兔和獭兔IFN-γ基因及检测其真核表达重组体的生物学活性,采用RT-PCR法从德系安哥拉长毛兔和白色獭兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增了IFN-γ基因,测序并序列分析;将该基因亚克隆入pVAX1载体,转染COS-7细胞,MTT法检测其生物学活性。结果表明,长毛兔和獭兔IFN-γ基因大小均为504 bp,两序列间仅在492位存在1个碱基的变异(A→T)。两序列推导的氨基酸序列相同,含167个氨基酸残基。长毛兔和獭兔IFN-γ核苷酸同源性为99.8%,与国内外学者报道的兔IFN-γ核苷酸同源性分别为100.0%和99.8%。基于NJ法构建的进化树发现,国内外学者所报道兔的不同品种均聚类在一起。通过脂质体法转染COS-7细胞,获得具有一定生物学活性的IFN-γ蛋白。结果表明,不同兔品种的IFN-γ基因间差异极小,具有较近的亲缘关系;且pVAX1-IFN-γ转染细胞后能表达具有生物学活性的蛋白。     

番鸭呼肠孤病毒YB株μA基因的克隆分析与原核表达

为了对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)μA基因进行克隆分析和原核表达,本研究设计了1对特异性引物,对MDRV-YB株的μA基因进行RT-PCR扩增,扩增产物经过双酶切后克隆到p ET-32a(+)载体中,经测序验证成功后,将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。随后对表达产物进行SDS-PAGE以及W estern-blot分析。结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株A基因的原核重组质粒,并获取了A蛋白的基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB株μA基因CDS大小为2 199 bp,负责编码732个氨基酸,该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为83.8%~99.7%,与新型鸭源呼肠孤病毒(NDRV)的同源性约为82.5%,与鹅源呼肠孤病毒(GRV)同源性为80.9%,而与禽(鸡源)呼肠孤病毒(ARV)的同源性仅为73.1%;进化树分析μA基因的结果显示,MDRV-YB株属于传统型呼肠孤病毒,该蛋白氨基酸序列中无潜在的信号肽序列,6个潜在的N-糖基化位点以及45个磷酸化位点;SDS-PAGE分析表明,目的蛋白为分子质量约为99.7 ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其IPTG最佳诱导温度为33℃,浓度为0.8 mmol/L,时间为6 h;Western-blot结果显示,表达的目的蛋白能与抗MDRV阳性血清发生特异性反应,表明其具备良好的反应原性。本研究为进一步探索MDRV μA蛋白功能奠定了基础。     

山羊源副流感病毒3型JS2013株HN基因的原核表达与抗原性分析

参考GenBank中牛副流感病毒3型(BPIV3)内蒙古09株(NM09)全基因组序列(GenBank登录号:JQ063064),设计了1对特异性引物以扩增山羊源副流感病毒3型(PIV3)JS2013株HN基因部分序列;将扩增到的基因测序后进行同源性分析。同源性分析结果表明,它与已报道的HPIV3、BPIV3 HN基因的序列同源性最高,分别为74.3%、79.8%。进化树分析表明,JS2013株并不属于HPIV3与BPIV3,形成一个独立的分支。将HN基因片段克隆至原核表达载体pET-32a(+),获得原核重组质粒pET-32a(+)-HN。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态菌株中,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE与Western-blot试验分析表明,重组蛋白诱导表达成功,并以包涵体形式存在,大小为46ku。经Western-blot试验验证,重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备的超免疫血清能够与重组蛋白反应;把病毒接种给MDBK细胞后,间接免疫荧光试验表明重组蛋白的多克隆抗体与病毒产生特异性荧光反应,表明该重组蛋白具有很好的免疫原性和反应原性。本试验结果为山羊源副流感病毒3型感染诊断方法的建立和疫苗的研制奠定了基础。     

重组鸡IFN-α的高效表达与一步复性和纯化

通过在线网站以及生物学软件分析,将天然鸡IFN-α基因中的稀有密码子同义替换为大肠杆菌偏好的密码子.优化后的基因经人工合成后与温控型表达载体pWL连接并转入大肠杆菌中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达产物的分子质量约为19 ku,表达量占总蛋白的28.3%.表达产物主要以包涵体形式存在,用高浓度变性剂溶解后,采用Sephadex G50凝胶过滤一步复性并纯化重组鸡IFN-α,纯度可达98%以上.每1 L培养基可以得到47.1 mg的重组鸡IFN-α,产出率达34.14%.表达的重组鸡IFN-α在CEF/NDV检测系统上的比活性为1.12×10~8U/mg.     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

利用RT PCR技术 ,用包容口蹄疫病毒完整VP1基因的引物从口蹄疫分离株 (China/99 2 )中扩增得到一约 75 0bp的DNA片段 ,克隆后 ,经对该片段的核苷酸序列进行测序和同源性比较 ,显示其与国外同源参考序列 (O1K/66)的同源性为 80 .44% ,与国内同型参考株 (HB/WH/99)的核苷酸序列的同源性达 99.0 6%。随后以重组质粒pGEM VP1为模板 ,用特异性表达引物扩增得到目的基因VP1 (65 0bp) ,对目的基因和表达载体 pGEX 4T 1分别以相同的限制性内切酶酶切后构建成重组表达载体 ,转化宿主菌BL2 1 (DE3 )后得到重组质粒pGEX VP1 ,经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序证明目的基因正确插入到表达载体。用IPTG诱导VP1基因的表达 ,收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳、Western blotting分析检测。结果表明 ,结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中表达 ,表达产物的分子量约为 5 3ku ,并能被口蹄疫阳性血清所识别。经薄层扫描分析 ,表达蛋白约占菌体蛋白总量的 2 0 .0 0 %。证明口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中高效表达 ,且表达产物有一定的生物学活性     

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5(MSP5)基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因。将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析。结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5α宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku。Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。     

重组鹅IFN-α蛋白在内含肽-冷激诱导表达系统中的表达

为了在大肠杆菌系统中高效表达具有抗病毒活性的重组鹅IFN-α(GoIFN-α)蛋白,在GoIFN-α基因上游融合内含肽Ssp Dnabmini-intein(SDI)序列,然后克隆至pET-43.1a(+)载体中,再将获得的pET-43.1a(+)-SDI-GoIFN-α重组载体和pColdⅢ载体分别进行双酶切,构建内含肽-冷激表达载体pColdⅢ-Nu-sA-SDI-GoIFN-α,将重组载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG低温诱导表达。结果表明,融合基因获得高效表达,表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。表达产物经Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经CGBQ-GPMV系统检测,证实表达的融合蛋白具有生物学活性,为后续的纯化工作和研究具有天然活性的重组鹅IFN-α奠定了基础。     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型标准菌株基因组为模板,用PCR扩增ApxⅠBD基因的特异性片段;对PCR产物纯化回收后与载体pMD 18-T进行连接、转化,经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pETⅠBD;转入大肠埃希氏菌BL21中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳。结果,从APP中克隆的ApxⅠBD DNA序列与已发表序列的同源性为100%,长1 447 bp,编码482个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku,与预期的大小相符。结果表明,含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

天府肉鹅IFN-α基因的克隆及生物信息学分析

采用RT-PCR方法从天府肉鹅外周血单核细胞中扩增了IFN-α基因;并将上述扩增片段克隆到pMD18-T载体中,构建了重组质粒。用生物信息学软件及在线分析方法对IFN-α基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行了分析,同时与13个物种的IFN-α基因进行了同源性比较。结果表明,成功地克隆了IFN-α基因,该基因与同类水禽(鸭、鹅)的IFN-α基因有90%以上的同源性,在进化树中位于同一分支,研究结果为开发鹅的干扰素制剂奠定了基础。     

鸭白细胞介素-2基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中登录的鸭IL-2基因序列设计并合成了1对特异性引物,以经ConA诱导的广州鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度为360 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切鉴定、PCR鉴定及序列测定结果表明,获得了鸭IL-2成熟蛋白基因的完整克隆.测序结果表明,该成熟蛋白基因由360个核苷酸组成,共编码119个氨基酸.克隆的鸭IL-2基因与GenBank上序列号为AYl73028及AF294322的鸭IL-2基因的同源性高达99.4%.将目的基因克隆至真核表达载体pPICZáC上,构建了重组质粒pPICZáC-DuIL-2.酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了鸭IL-2基因.SDs-PAGE分析证实,鸭IL-2基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达成功,表达的重组蛋白的分子质量约为14.3 ku.     

猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间片段的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间的目的片段经克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导重组菌株表达其融合蛋白.结果显示,目的片段的大小为357bp,序列分析表明,S基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测表明,分子质量约34ku的融合蛋白具有良好的反应原性.     

番鸭呼肠孤病毒YB株NS基因的序列分析及原核表达

为实现番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株NS非结构基因的克隆分析及原核表达,首先经RT-PCR扩增NS基因的完整编码序列(CDS),并将其克隆到p ET-32a(+)载体中。测序后对获得的NS基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。测序结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株NS基因的原核重组质粒p ET-YB-NS,并获取了NS基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB NS基因的CDS大小为1 908 bp,编码635个氨基酸;该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为98.2%~99.4%。遗传进化树分析显示,MDRV-YB株处于传统型MDRV分支上。该蛋白氨基酸序列中并不含有潜在的信号肽序列,但是含有2个潜在的N-糖基化位点以及61个磷酸化位点。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,成功高效表达出分子质量约为88.7 ku的融合蛋白(p-NS),表达时IPTG最佳诱导时间、浓度和温度分别为5 h、0.4 mmol/L和36℃。Western-blot结果显示,表达的p-NS蛋白能特异性识别MDRV阳性血清,表明表达产物具备良好的反应原性。上述结果表明,MDRV NS非结构基因的克隆分析及其蛋白表达的实现,为进一步研究MDRV NS蛋白功能奠定了基础。