牛血孢子虫单一种分离技术及其保藏方法的研究——双芽巴贝斯虫纯种虫株的分离

本文报道了牛双芽巴贝斯虫纯种虫株的分离方法和步骤。将洁净微小牛蜱幼虫饲喂在事先人工感染的混合种带虫牛体上,收集感染的饱血雌虫,俟次代幼虫孵出后,将其释放到另一健康易感牛体上,自行叮咬18天之后,从该头牛体上摘下450只半饱雄虫,人为地移至另一健康牛体上,使其继续叮咬。雄虫叮咬后的第13天,在该头牛的血液涂片中,出现了典型的双芽巴贝斯虫,在其后30天的检查过程中,未发现其他种虫体。感染后第13天,体温开始升高,最高达39.6℃,持续3天;第20天染虫率达到6.11％的高峰;第27天出现血尿。同时对红白细胞进行了计数,并观测了某些临床症状。     

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫纯种虫株的分离

本试验对感染双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫混合种的牛连续注射1％台盼蓝溶液3天,用其脑匀浆滤液接种健康易感牛,未分离出牛巴贝斯虫单一种。将洁净微小牛蜱幼虫释放到牛体叮咬10天后,用混合种含虫血感染牛,收集饱血雌虫,置28℃、相对湿度约90％的条件下产卵孵化,用次代幼虫分批感染健康易感牛5头,准确地于幼虫释放后5、4、3天,用杀虫剂杀死正在吸血的幼虫终止感染,对试验牛逐日耳尖采血涂片检查,仅3天杀死幼虫的牛只感染有牛巴贝斯虫单一种。试验结果表明,台盼蓝不能杀灭双芽巴贝斯虫;脑涂片中尽管有大量牛巴斯虫,但它不是寄生于该部位的唯一种;叮咬3天的次代幼虫仅传播牛巴贝斯虫。     

甘肃张家川牛卵形巴贝斯虫的分离及补充传播试验

利用甘肃张家川牛体所采集的长角血脾饱血雌虫的次代幼虫，叮咬除脾健康易感牛，于第９天的未稍血液涂片中，发现了典型的卵形巴贝斯虫，第１２天染虫率达到３．１２％的高峰，随后下降至带虫水平。这是在甘肃省首次发现并分离出的一株卵形巴贝斯虫。试验证实，长角血脾雄虫也具有传播卵形巴贝斯虫的能力，卵形巴贝斯虫也可以通过长角血脾隔代垂直传播，这两个结果尚属首次报道。在自然感染牛体采集的饱血雌虫血淋巴涂片中也观察到了卵形巴贝斯虫大裂殖子。     

莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫在我国的分离及形态学观察

在甘肃省庆阳地区的发病及病愈的小尾寒羊血液中分离出２种巴贝斯虫并进行了形态学观察，初步证实该地区“坏肠子”病的病原为巴贝斯虫，一种小型虫体鉴定为羊巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａｏｖｉｓ）。另一种为大型虫体，鉴定为莫氏巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａｍｏｔａｓｉ）。含羊巴贝斯虫的血液注射给除脾羊后，第１４ｄ血涂片中红细胞的染虫率达最高点（为０．５％），之后逐渐下降，感染羊自然耐过。含有混合虫种的血液注射给易感除脾羊后，红细胞染虫率迅速上升至３０．０％，感染后第６ｄ羊因巴贝斯虫病死亡。对２种虫体做了量度和形态学描述，并与欧洲的相同虫种作了比较。     

微小牛蜱对牛巴贝西虫和双芽巴贝西虫传播能力的研究

河南省卢氏县为午巴贝西虫和双芽巴贝西虫的混合感染地区。将该地区自然感染的微小牛蜱的饱血雌虫置28℃产卵和孵育,然后分别用其次代幼虫、若虫和成虫感染除脾牛,结果证明微小牛蜱能经卵传递牛巴贝西虫和双芽巴贝西虫。幼虫不仅能传播牛巴贝西虫,同时也能传播双芽巴贝西虫。若虫和成虫只能传播双芽巴贝西虫,对午巴贝西虫不再具有传播能力。用若虫感染除蜱牛分离出1株纯双芽巴贝西虫。     

甘肃省宁县两种羊巴贝斯虫的传递试验

将采自甘肃省宁县湘乐镇柏树底村自然感染绵羊的含虫血，用液氮保藏，带回实验室后解冻，经颈部皮下以５０ｍＬ分别接种未除脾绵羊１只，除脾山羊１只。用采自疫区羊体的半饱血若虫和成虫（后经鉴定系森林革蜱和长角血蜱）、饱血若虫（在实验室蜕化为成虫，系长角血蜱）、森林革蜱次代幼虫，各自分别叮咬感染１只未除脾绵羊。结果含虫血接种的绵羊和山羊均被感染，在血液涂片中观察到了两种巴贝斯虫，一种是大型的巴贝斯虫未定种，另一种是小型的绵羊巴贝斯虫，潜伏期为９～１１ｄ。蜱叮咬的羊只均未感染成功。     

我国牛蜱传性血液原虫的虫种调查和分布特征的研究

利用病原检查法对我国２６个省（区）的３１８４头牛进行了牛蜱传性血液原虫调查，并研究了不同生态地区虫种的分布特征。调查共发现双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、大巴贝西虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、突变泰勒虫和边缘边虫７种病原。双芽巴贝西虫分布于云南、贵州、四川等省，感染率为０．９７％～１．５％，媒介蜱为微小牛蜱和镰形扇头蜱。牛巴贝西虫分布于云南、贵州、湖南、湖北等省，感染率为２．３８％～５６．６６％，媒介蜱为微小牛蜱和镰形扇头蜱。大巴贝西虫分布于河南、甘肃、辽宁、新疆等省（区），感染率为１６．６５％～４０％，媒介蜱为长角血蜱和刻点血蜱。环形泰勒虫分布于宁夏、新疆、内蒙、甘肃等省（区），感染率为１７．２４％～３５．３０％，媒介蜱为残缘璃眼蜱。瑟氏秦勒虫分布于云南、贵州、广东、广西等省（区），感染率为３４．６７％～１００％，媒介蜱为长角血蜱。突变泰勒虫分布于贵州、新疆、西藏等省（区），感染率为４５％～５５％，媒介蜱为刻点血蜱。边缘边虫分布于云南、贵州、湖南、湖北等省，感染率为２０％～７９．３１％，媒介蜱为微小牛蜱和镰形扇头蜱。     

牛血孢子虫单一种分离技术及其保藏方法的研究——牛边缘边虫纯种虫株的分离

本文叙述了牛边缘边虫的分离方法和步骤。将洁净微小牛蜱幼虫培育在接种含边缘边虫混合种虫血的牛体上,叮咬17天后,摘取600只(雌雄各半)未饱血成虫,人为地移至另一头易感健康牛体上。于继续叮咬后13天,在该头牛的血液涂片中发现了典型的边缘边虫。至33天时染虫率达到高峰,为53.11％,个别红细胞 内的感染强度高达9～10个虫体。35天染虫率降至41.34％,牛只死亡。在该头牛虫体出现至死前23天的涂片中,只见到了单一的边缘边虫,未发现其他形态的虫体。同时对感染牛只的血红蛋白、红白细胞数及临床症状等进行了观测。为了使染虫率升高,在本试验中采用了肌注氢化泼尼松的办法,起到了与手术除脾差不多的效果,且省事安全。     

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫在其媒介蜱血淋巴中的裂殖子观察

将洁净微小牛蜱幼虫和长角血蜱饥饿成虫分别饲喂到人工感染牛巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫单一种的牛体上,收集脱落饱血雌虫培育,逐日用断腿法制作血淋巴涂片观察。结果微小牛蜱脱落后第4天的血淋巴中,就观察到了牛巴贝斯虫的游离大裂殖子,其形态似压扁的圆锥体,前端大而钝,后端小而尖,有的尖端稍弯曲或弯曲如钩状。虫体中央有1～3个圆形的核,绝大多数为1个。原生质中有数目不等的空泡,大小为9.0～22.0×1.5～6.0μm,平均13.6×3.14μm。另有圆环形、逗点形、蝌蚪形及其它形态的裂殖子,大多周边布有染色质带,中央往往呈现出一个大空泡。在脱落后第4天的个别长角血蜱的血淋巴涂片中,就可查到大裂殖子,直到第20天,存活蜱的涂片中还可检出。蜱全部获得感染,但虫体出现的时间不规律,仅在少数蜱的涂片中可连续观察到。其形态与上述牛巴贝斯虫血淋巴中典型大裂殖子相似。大小为10.0～19.0×1.5～4.5μm,平均13.84×3.72μm。     

羊源巴贝斯虫未定种甘肃敦煌株的发现

采用动物接种法将采自甘肃敦煌的15只绵羊血液混合后感染1只除脾绵羊,感染后逐日做血涂片检查。结果显示,在感染后第10天的血片上出现了1种大型巴贝斯虫。虫体形态以双梨子形、单梨子形、圆形及卵圆形为主。在感染后第12天,感染羊体温升至41.1℃。染虫率达到0.125%,之后逐渐下降。无菌采集该羊血液,提取全血基因组,用梨形虫通用引物进行PCR扩增全长18SrRNA基因,得到长约1 700bp的片段,将其克隆并测序(登录号:HQ730762),与GenBank中的其他巴贝斯虫的序列进行比较,发现其与新疆巴贝斯虫未定种的同源性最高,达到99.8%。本研究发现甘肃敦煌又是一个新疆羊巴贝斯虫未定种的疫源地。     

犊牛摘脾术的发展现状

摘脾术已广泛应用到某些蜱媒疾病的研究和防制技术中,如在摘除脾脏的动物体内繁殖边虫(Anaplasma)、巴贝斯虫(Babesia)、附红小体(Eperythrozoon)等病原体,供制备诊断液或疫苗。澳大利亚蜱热病研究中心(TickFever Research Centre)是一个具有40年历史的专业研究机构,1956年开始用摘脾牛研制巴贝斯虫病和边虫病的诊断制剂和疫苗。1986年增添了一     

体外培养牛巴贝斯虫致病力的观察

体外培养的牛巴贝斯虫，经液氮保存５个月后取出，迅速解冻，皮下接种于二头去脾水牛犊（含虫均为２×１０￣８个）。接种后二头牛分别从第１１天和第１７天体温升高，最高达４０℃和３９．８℃，红细胞压积分别降为２９％和２６％，血红蛋白含量最低分别降为５０ｇ／Ｌ和４０ｇ／Ｌ。接种后第１５天和第１９天，外周血液中虫体含量最高，红细胞染虫率分别达５％和６％，试验牛出现明显的临床症状，如贫血、结膜黄染、粪便稀薄、食欲减退、精神不振，其中１头死亡。说明体外连续培养２０、３０天的牛巴贝斯虫，其毒力没有下降，对牛具有感染性并能使其发病，与自然发病的强毒株人工感染牛没有差异。     

浅谈卵形巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫病

Minami等(1980)在发表卵形巴贝斯虫(Babesiaovata Minami and Is-hihara,1980)新种时的文章中回顾到,自1911年Tokishige首次报告日本的牛感染有巴贝斯虫以来,许多学者对分布于日本(除冲绳而外)牛的一种大型的巴贝斯虫未定种进行了长时间的研究,对分类地位进行了讨论。To-kishige和Ogura(1929)把这个种认作为双芽巴贝斯虫(B.bigemina)或与此相关的种,而Iseki(1924)却认为是与牛巴贝斯虫(B.bovis)或分歧巴贝斯虫(B.divargens)相关的种。Ishiha-ra(1968)证实,日本牛的巴贝斯虫是由纽曼氏血蜱(Haemaphysalis neumanni,即H.longi-cornis)通过次代幼虫传播,同时也指出该种在     

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——微小牛蜱对边缘边虫的传递试验

将洁净微小牛蜱幼虫释放到感染有边缘边虫的牛体上,摘取正在吸血的半饱成虫、饥饿成虫、半饱稚虫,分别人为地转移到3头健康易感牛体上事先用锌明胶贴好的布袋中。使其继续叮咬,试验牛均遭感染,其潜伏期分别为13天、13天、19天。最高染虫率分别达53.1％、12.0％、8.6％,用从感染牛体脱落饱血雌虫的次代幼虫,叮咬4头健康易感牛,检查时间最短的为30天,最长的达180天,在整个检查过程中,4头试验牛的血液涂片,始终均未发现边缘边虫。试验证明,边缘边虫不能通过微小牛蜱经卵传递,只有当代各变态期的蜱,由感染牛体转移到易感牛且继续叮咬时,才能使边缘边虫得以传播。     

羊的大型巴贝虫未定种的形态学和致病性初步研究

用采自新疆羊体的半饱血血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)与小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum)成虫感染1只除脾绵羊.感染后逐日做血片检查,在感染后第11d的血片上发现一大型巴贝虫(Babesia sp.).虫体形态以双梨子形、单梨子形、圆形及卵圆形虫体为主,双梨子形虫体大小为3.0-4.0 gm×1.1-2.1μm.在感染后第14 d,感染羊体温升至41.2℃.染虫率最高达到0.25%,之后逐渐下降.感染羊自然耐过.     

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——感染微小牛蜱饱血雌虫血淋巴检查技术

洁净微小牛蜱幼虫,在健康易感牛体上叮咬10天后,试验牛再用液氮保藏的双芽巴贝斯虫接种。收集脱落的饱血雌虫,将其培育在28℃、相对湿度约85％的温箱中,采用断腿法和穿刺法逐日制作血淋巴涂片。检查结果表明,饱血雌虫脱落后的第3天在其染色血淋巴涂片中,就可见到早期未成熟裂殖体,第5天观察到成熟裂殖体,第6天有典型游离的大裂殖子出观。第12天大裂殖子达最高峰。其形态呈棒状,前端大而钝固,后端小而尖,大小范围为7.0～19.0×1.5～4.0μm,平均为12.49×2.75μm。断腿法与穿刺法检出的符合率为100％。在卵的压片中见到梭形和小梨子形虫体。在次代幼虫的压片中,观察到大量的小裂殖子集群。     

田鼠巴贝斯虫感染对宿主凝血系统的影响

为研究田鼠巴贝斯虫感染对宿主凝血系统的影响,通过凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)的检测来进行评价。结果显示,随着染虫率的变化,PT值没有显著变化(P0.05),APTT值在感染初期随着染虫率升高显著地降低(P0.01),而且在染虫率高峰期APTT值降到了最低,使凝血时间显著缩短,感染后期随着染虫率降低,APTT值恢复到正常水平,这表明田鼠巴贝斯虫主要通过影响宿主内源性凝血途径使凝血时间缩短。本试验结果将为田鼠巴贝斯虫感染相关致病机制的研究提供一个新思路。     

牛巴贝斯虫病ELISA诊断方法的建立

以BORCT蛋白为包被抗原,优化最佳反应条件,确定阈值并测定其交叉反应,建立了一种特异性检测牛巴贝斯虫抗体的间接ELISA方法。利用该方法测定了试验感染的2头牛的抗体动态曲线,并对我国四川、甘肃、新疆3个省(自治区)的314份牛血清样品进行了检测。结果显示,经MedCalc 12.7.3.0软件分析86份阴性血清和69份阳性血清的检测结果,确定29.6%抗体比率为该方法的阳性阈值,对应的敏感性和特异性分别为94.2%和96.5%,并且与其他巴贝斯虫、泰勒虫和无浆体阳性血清均无交叉反应。对试验感染动物的检测结果显示,感染后的第6天出现特异性抗体,第12天达到最高值,一直持续到第270天。野外样品检测结果显示,3个省份均有牛巴贝斯虫的分布,平均阳性率为46.82%。     

牛大巴贝西虫在我国的发现及其媒介蜱的确定

首次在我国发现和分离出一株牛的大巴贝西虫并确定了其媒介蜱为长角血蜱。1988年4月,从河南省卢氏县同一群黄牛体上采集到长角血蜱饱血雌虫4只和微小牛蜱饱血雌虫16只,然后分别用其第二代幼虫、若虫和成虫感染除脾小牛。结果证明长角血蜱饱血雌虫能经卵传递大巴贝西虫,第二代幼虫对牛具有感染力,若虫和成虫不能感染。微小牛蜱的幼虫、若虫和成虫各期都不能传播这种巴贝西 虫。长角血蜱幼虫感染的小牛,红细胞内的虫体稍小于双芽巴贝西虫,大于牛巴贝西虫,双梨子形虫体较宽,其量度为3.1～3.7×1.5～2.3μm,长宽指数为1.87。     

双芽巴贝斯虫Hsp20一新基因型的发现及生物学特性分析

为了鉴定分离自甘肃永靖的1株双芽巴贝斯虫Hsp20基因型为一新基因型,参考双芽巴贝斯虫Hsp20核苷酸序列,设计特异性引物。对其进行扩增,利用生物信息学方法对其进行比对分析。结果显示,扩增获得了700 bp的核苷酸片段。与GenBank中公布的18种不同物种的氨基酸序列构建遗传发育树,结果表明本实验获得的双芽巴贝斯虫与美国株和中国新疆株的亲缘关系最近。对其氨基酸序列进行比对分析,发现在第31～85位点存在冗余,与公布的Hsp20氨基酸序列存在明显的差异。通过同源建模分析,发现该冗余致使Hsp20蛋白在第7号位形成1个环形结构,从而引起了第3号位的拉伸。通过生物信息学分析得出,获得的双芽巴贝斯虫甘肃株的Hsp20基因是一新基因型。该基因型的存在为更加准确诊断双芽巴贝斯虫病提供了依据。