伊氏锥虫同工酶的研究

本文对我国5株伊氏锥虫的5种同工酶进行了初步研究。应用琼脂糖凝胶电泳技术检测了5株伊氏锥虫的苹果酸脱氢酶(MDH)、L-苹果酸辅酶Ⅱ氧化还原酶(ME)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、葡萄糖磷酸异构酶(GPI)和已糖激酶(HK)。5株伊氏锥虫的MDHME同工酶谱均相同,而G6PD、GPI和HK的同工酶谱显示出差别。分析表明,尽管某些同工酶谱存在着差异,但从总体水平分析,这些伊氏锥虫同工酶谱仍具有较高的相同性,属同源种群。     

用随意扩增的DNA多态性鉴定中国分离的部分旋毛虫虫株

以旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌａｓｐｉｒａｌｉｓ）国际标准虫种作对照，利用随意扩增的ＤＮＡ多态性技术对国内的部分旋毛虫分离株进行了鉴定与分析。经５条引物的单扩增及复合扩增结果显示，中国的旋毛虫猪株为Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ，犬株为Ｔ．ｎａ－ｔｉｖａ，猫株为Ｔ．ｎｅｌｓｏｎｉ。     

我国旋毛虫地理株基因组DNA多态性的RAPD分析

以旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)、乡土旋毛虫(T.nativa,T2)、布氏旋毛虫(T.britovi,T3)、伪旋毛虫(T.pseudospiralis,T4)、纳氏旋毛虫(T.nelsoni,T7)的国际参考株作为对照,应用随机扩增多态性DNA技术对我国7个旋毛虫地理株(河南、湖北、云南、陕西西安、天津、黑龙江同江及哈尔滨株)基因组DNA进行了PCR扩增,根据扩增产物的电泳条带进行MEGA分析,计算遗传距离并构建进化树.结果显示,T1与我国7个旋毛虫地理株之间的遗传距离均小于0.365 9,其中哈尔滨株与云南株、河南株与西安株的遗传距离小于0.166 7,其遗传相似性分别为83.33%与86.35%;天津株与哈尔滨株及云南株的遗传距离小于0.250 0;同江株与其他6个地理株的遗传距离均大于0.284 1,与T1的遗传距离小于0.263 3;湖北株与其他6个地理株及T1的遗传距离大于0.301 3.T2、T3、T4、T7与我国7个地理株之间的遗传距离均大于0.589 8.我国7个旋毛虫地理株均为T1,其中哈尔滨株、云南株及天津株归为一类,河南株与西安株归为一类,同江株与湖北株各单独归为一类.     

旋毛虫LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种快速、准确的动物肉品中旋毛虫检测方法,根据旋毛虫ITS-Ⅱ基因序列,设计环介导等温扩增技术(loop-m ediated isothermal amplification,LAMP)引物,进行LAMP扩增。将旋毛虫DNA进行梯度稀释,以其为模板分别进行LAMP和常规PCR扩增,分析LAMP检测技术的敏感性。分别以旋毛虫、弓形虫、捻转血矛线虫、柔嫩艾美耳球虫、猪囊尾蚴、大肠杆菌等病原的基因组DNA为模板,进行LAMP检测,分析该检测方法的特异性。用该LAMP检测方法,分别对模拟样品和市售猪舌、鸭舌、鸡舌、羊舌和牛舌等110份样品进行旋毛虫感染情况检测。LAMP扩增产物的电泳结果和可视化SYBR G reen I荧光染料颜色的变化均表明该LAMP检测方法建立成功。当模板DNA稀释到10~(12)时亦可以检测,其敏感性是常规PCR的1 000倍。特异性研究发现,只有以旋毛虫基因组DNA为模板所进行的LAMP检测才出现阶梯形的电泳条带并且其SYBR Green I荧光染料呈现绿色荧光。在2 g肌肉中添加1条旋毛虫肌幼虫时亦能被该LAMP方法检测出来。但110份舌肌样品中均未检测到旋毛虫,LAMP检测结果与常规PCR结果一致。结果表明,本研究建立了基于旋毛虫ITS-Ⅱ基因的LAMP检测技术,该技术具有较好的敏感性和特异性,在样品检测中具有简便快捷的优点。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsSerpin)基因的克隆及序列分析

为了分析旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsSerpin)的分子特征,提取了旋毛虫标准株ISS534,河南、云南、天津、西安、哈尔滨等6个猪旋毛虫分离株基因组DNA,设计引物进行PCR扩增,克隆不同虫株TsSerpin基因组的DNA序列。将PCR产物连接到pMD18-T载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行序列测定,利用生物信息学软件对TsSerpin基因序列进行预测分析。结果显示,TsSerpin cDNA序列含有1个由1 122个核苷酸组成的开放阅读框,编码由373个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量的理论值为42.5ku,理论等电点为6.54。该蛋白的二级结构中,α螺旋占36.7%,β折叠占25.2%,其余38.1%为无规则卷曲。TsSerpin第14~373位氨基酸序列为Serpin结构域,具有Serpin的保守序列FVADHPFLFFI。线性B淋巴细胞抗原表位分析显示,TsSerpin中含有12个潜在的B细胞抗原表位。TsSerpin基因的开放阅读框对应的基因组序列包含3个外显子和2个内含子。不同旋毛虫分离株TsSerpin序列高度保守,一致性在99%以上。上述研究结果为进一步研究TsSerpin蛋白的生物学功能和研制新型抗旋毛虫疫苗奠定了基础。     

旋毛虫肌幼虫抗原的SDS-PAGE及EITB分析

本文应用SDS-PAGE及酶联免疫电转移印迹(EITB)技术对旋毛虫肌幼虫可溶性抗原进行了初步分析。结果SDS-PAGE可显示15条多肽带。感染旋毛虫猪血清可特异性地识别6种多肽抗原。本项研究为进一步分析、分离旋毛虫功能性抗原打下了基础。     

华南地区军警犬弓形虫旋毛虫血清抗体调查

采用酶联免疫吸附试验对广西、广东军警犬进行了弓形虫和旋毛虫血清抗体调查。采样１０１份，其中广西３０份，广东７１份。检出弓形虫抗体阳性５份，阳性率４．９５％；旋毛虫抗体阳性１份，阳性率０．９９％；广西的弓形虫、旋毛虫阳性率均为３．３３％；广东弓形虫阳性率为５．６３％，旋毛虫未检出。     

应用旋毛虫GAD和GLS重组抗原建立间接ELISA方法的研究

为了建立快速检测猪旋毛虫病的血清学方法,分别用旋毛虫GAD、GLS重组蛋白作为包被抗原,建立2种检测旋毛虫血清抗体的间接ELISA方法。对抗原包被条件、血清稀释度、封闭液的选择与封闭时间、酶标二抗的稀释度与孵育时间和TM B作用时间等条件进行了优化。旋毛虫GAD包被抗原间接ELISA方法和GLS包被抗原间接ELISA方法的阴阳性临界值分别为0.848和0.963;这2种间接ELISA方法批内和批间重复试验的最大变异系数均小于10%,且用这2种方法分别对猪蛔虫阳性血清、华支睾吸虫阳性血清和弓形虫阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明这2种方法具有很好的稳定性和特异性。同时用这2种间接ELISA方法和旋毛虫抗体快速检测卡分别对感染旋毛虫不同数量、不同时间的小鼠血清进行检测,结果显示,这2种间接ELISA方法具有较高的敏感性。本研究中建立的这2种间接ELISA方法为旋毛虫病的早期诊断和流行病学调查提供了必要的手段。     

磁水对猪蛔虫卵不同发育阶段MDH EST和LDH同功酶的影响研究

笔者观察了磁水对猪蛔虫卵不同发育阶段的苹果酸脱氢酶(MDH)、酯酶(EST)、和乳酸脱氢酶(LDH)同功酶的影响。结果表明:虫卵在同一条件下经不同时间发育后,三种同工酶的酶带数目和迁移率(Rf)均有不同;同时还观察到虫卵在不同环境中发育,在磁水作用下经不同发育阶段其同功酶酶带数目和Rf与自来水作用下比较有明显差异。此外还对猪蛔虫卵在磁水中发育延缓的可能因素做了初步分析。     

猪旋毛虫不同发育时期虫体49 ku ES抗原基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已登录的猪旋毛虫49 ku ES抗原基因序列设计了1对引物,用SDS裂解液配合蛋白酶K方法从猪旋毛虫不同发育时期(成囊前期幼虫、肌幼虫、成虫)虫体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增49 ku ES抗原基因,将目的基因定向克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希氏菌TG1。用PCR、限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行单、双酶切鉴定,阳性质粒的测序结果表明,成功克隆了猪旋毛虫不同发育时期虫体49 ku ES抗原基因。序列分析结果显示:49 kuES抗原基因大小为948 bp,基因的保守性很强,序列同源性比较高,不同发育时期之间的差异很小。     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆与原核表达

根据GenBank中旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Tsserpin)基因序列设计1对引物,从旋毛虫肌幼虫提取总RNA,应用RT-PCR扩增获得目的基因片段,进行限制性酶切后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-Tsserpin,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,经PCR、限制性酶切分析及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,表达产物纯化后用Western-blotting鉴定Tsserpin重组蛋白的抗原性。PCR与酶切鉴定结果显示,构建的重组表达质粒pET30a-Tsserpin与预期结果一致。测序结果表明,插入片段为1122bp,编码373个氨基酸,与GenBank中旋毛虫Tsserpin基因的相似性为99%。含有pET30a-Tsserpin重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE分析结果显示,表达产物的分子质量约为48.5ku,而且主要以包涵体形式存在。Western-blot分析结果表明Tsserpin重组蛋白可以被旋毛虫感染猪阳性血清特异性识别,提示其具有良好的抗原性,可以作为猪旋毛虫病免疫诊断的候选抗原。     

旋毛虫新生幼虫的体外培养

(一)材料与方法 1.实验动物:实验用Wistar系大白鼠购自兰州医学院动物室,体重180～250g;昆明系小白鼠由本所动物饲养场提供。 2.旋毛虫虫株:实验用旋毛虫为本实验室用大白鼠传代保存的河南新野猪源旋毛虫。 3.新生幼虫的收集:给大白鼠经口感染7000～8000条肌幼虫后第6天剖杀;取小肠剪成2～3cm     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。     

西藏那曲地区旋毛虫分离株的分子分类鉴定

从西藏那曲地区旋毛虫抗体阳性藏猪获取膈肌组织,显微镜检查后采用人工消化法收集旋毛虫肌幼虫。提取旋毛虫基因组,以旋毛虫(T.spiralis)和乡土旋毛虫(T.nativa)标准株为对照,应用线粒体核糖体小亚基及大亚基RNA特异引物进行PCR扩增,结果扩增产物为650bp,与T.spiralis一致。对西藏那曲旋毛虫分离株的5SRNA内转录间隔区基因进行PCR扩增及序列测定,与GenBank数据库中已知的旋毛虫序列进行比对分析,确定其分类地位。结果扩增到735bp的片段,与T.spiralis的相似性达到99%,仅有3个核苷酸不同,可以归为一类。结果表明,西藏那曲旋毛虫分离株应该属于T.spiralis。     

旋毛虫单克隆抗体特性鉴定

将两株抗旋毛虫单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞（Ｄ４,Ｅ２）所分泌的ＭｃＡｂ,经纯化后电泳分析,其重链分子质量为５５ｋｕ,轻链分子质量为２９ｋｕ,符合ＩｇＧ抗体的特点。两株ＭｃＡｂ与旋毛虫阳性猪血清所针对的旋毛虫抗原决定簇相同,都不与猪的其它寄生虫发生交叉反应,与抗原的相对亲和力Ｅ２＞Ｄ４,ＭｃＡｂ亲和层析纯化抗原的分子质量为４９ｋｕ,经免疫斑点染色证明为糖蛋白。     

旋毛虫成虫 新生幼虫及肌幼虫的收集方法

(一)材料与方法 1.供试动物: (1)小白鼠:实验用昆明小白鼠购自本所健康动物饲养场的封闭群。 (2)大白鼠:实验用Wistar系大白鼠购自兰州医学院动物研究室,体重180～250g,雌雄均有。 2.旋毛虫虫种:实验用旋毛虫虫种为本实验室用大白鼠传代保存的河南邓县猪源旋毛虫。     

旋毛虫cystatin-like基因重组蛋白诊断特性的鉴定

为鉴定旋毛虫肠道期肌幼虫cystatin-like基因重组蛋白的诊断特性,利用ELISA方法,以旋毛虫cystatin-like基因重组蛋白作为包被抗原,并以旋毛虫感染早期肠道6 h幼虫ES抗原作为阳性对照,用不同旋毛虫感染剂量、不同感染时间小鼠血清为一抗,检测血清中抗旋毛虫Ig G抗体的变化情况,利用Excel软件绘制出Ig G抗体消长规律曲线并进行数据分析,鉴定该基因重组蛋白作为诊断抗原时的敏感性及诊断效果。结果显示,在低剂量感染和高剂量感染时,该基因重组抗原分别从感染后第10天和第8天起可以稳定地检测出抗旋毛虫Ig G抗体;在感染后第11天至第45天一直呈"波峰波谷"式并维持较高水平;感染早期(第15~45天)低剂量感染组的Ig G抗体水平明显高于高剂量组。由此推断,旋毛虫cystatin-like基因重组蛋白具有很好的早期诊断特性,尤其对低剂量早期感染的诊断效果更佳,并推测该基因极有可能在旋毛虫感染早期对宿主的免疫抑制作用中起重要作用,其具体应用前景和生物学功能还有待于进一步研究。     

猪A群轮状病毒LN-01-2013株的分离与鉴定

将病料与等体积2.5g/L胰酶溶液混合均匀,于37℃恒温培养箱中孵育1h,分别接种于MA-104、Marc-145、ST细胞系以分离病毒并筛选该毒株最适细胞系。通过RT-PCR以及重组质粒构建对其进行分子生物学鉴定以及遗传进化分析。结果显示,成功分离出猪A群轮状病毒LN-01-2013株,MA-104细胞系为其最适细胞系。LN-01-2013株的VP4基因型与P[7]基因型同源性最高,VP7基因型与G[9]基因型同源性最高。根据A群轮状病毒最新分类方法,LN-01-2013分离株属于P[7]G[9]型。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,共获得6株能稳定分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/7B6和6G7/8D3,并通过ELISA、Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对6株单抗的特性和抗原表位进行分析鉴定。结果显示,6株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024～1∶2 048,腹水效价为1∶163 840～1∶204 800。3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3的亚型为IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7为IgG2b型,所有单抗的轻链均为κ型。Western-blotting和IFA结果表明6株单抗均能与重组Cap蛋白和PCV2产生特异性反应。相加ELISA结果显示,6株单抗可能识别不同的抗原表位。为准确鉴别不同单抗针对的抗原位点,以截短表达的重组Cap蛋白为抗原,进行Western-blot鉴定。结果显示,4A9/3E2与4A9/3D7的抗原表位位于101～150aa,其余4株单抗可能针对1～50aa或者天然...     

猪三毛滴虫长春株的形态观察及其5.8 S rRNA基因分析

对从长春地区腹泻仔猪结肠中分离到的1株毛滴虫进行了形态观察,并采用PCR扩增该毛滴虫的5.8SrRNA基因,测序后与国外已报道的三毛滴虫进行核酸同源性分析,并应用DNAStar软件绘制系统发育进化树。形态观察表明分离的毛滴虫为猪三毛滴虫。猪三毛滴虫长春分离株5.8SrRNA序列与国外已报道的三毛滴虫高度同源。系统发育进化树表明该序列与已报道的猪三毛滴虫5.8SrRNA(序列号U85966.1),牛胎儿三毛滴虫5.8SrRNA(序列号U85967.1,AF339736.1,AF466749.1,AF466750.1,AF466751.1)和T.mobiliensis5.8SrRNA(序列号U86612.1)同属于一个亚群,但与另1株猪三毛滴虫5.8SrRNA(序列号AY349190.1)亲缘关系较远。形态观察和5.8SrRNA基因分析表明,从长春地区分离的猪毛滴虫为猪三毛滴虫。