含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3′非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较,结果显示,HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%。同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。     

含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3''''非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列.测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基.经与参考毒株进行序列比较,结果显示, HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%.同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较.结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域.     

口疮病毒VIR蛋白多克隆抗体的制备及VIR蛋白的亚细胞定位观察

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western-blot鉴定抗体的反应原性。利用脂质体介导法将pEGFP-VIR质粒转染绵羊睾丸细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后激光扫描共聚焦显微镜观察VIR在细胞内的表达和亚细胞定位。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GSTVIR蛋白,主要以可溶性形式存在,其分子质量约27ku,制备的多克隆抗体效价达1∶218;Western-blot分析结果显示,此多克隆抗体有较好的特异性反应;VIR蛋白主要定位于细胞核内。本试验结果为VIR生物学功能的深入研究奠定了基础。     

绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pEGFP-NSP9的构建与表达

为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染Marc145细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和NSP9基因转录水平。结果显示,经双酶切及PCR鉴定,目的基因的大小与预期相符。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有NSP9基因的转录。本研究成功构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因GFP融合表达质粒,为在细胞水平快速筛选有效的siRNAs提供了工具。     

山羊溶血性曼氏杆菌2型的分离鉴定

为了确定某养殖场奶山羊细菌性感染导致死亡的具体病原种类,从送检的肺和肝组织病料中分离纯化细菌。通过生化培养特性观察、16S rRNA和毒力基因的PCR扩增、血清型鉴定、药敏试验和致病性试验来鉴定病原种类。结果显示,从送检的组织中分离出2株革兰阴性球杆菌;16S rRNA和毒力基因LKT测序结果表明,所分离的病原菌为溶血性曼氏杆菌,血清型鉴定均为溶血性曼氏杆菌A2型,故可确定分离株为具有致病性的溶血性曼氏杆菌2型。药敏试验结果显示,分离株对羧苄西林、庆大霉素敏感,对氨苄西林、卡那霉素等中度敏感,而对复方新诺明具有耐药性。小鼠致病性试验表明,接种分离株后小鼠于24 h内陆续死亡,并从剖检小鼠肺中也检测到溶血性曼氏杆菌,表明该菌有一定的致病力。结果表明,造成山羊死亡的主要病原是溶血性曼氏杆菌,这为溶血性曼氏杆菌病的临床用药提供了参考。     

BHK-21细胞蛋白样品双向凝胶电泳条件的优化

分别从BHK-21细胞处理方法、样品上样量、聚丙烯酰胺凝胶浓度和染色方法4个方面优化了BHK-21细胞蛋白双向凝胶电泳的技术条件,以为口蹄疫病毒感染细胞比较蛋白质组学研究奠定基础。结果表明,处理细胞时,采用超声破碎方法优于反复冻融方法;用考马斯亮蓝染色时,7cm胶条上样量为100μg时图谱的蛋白点较多且分离清晰;浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶所得的蛋白点较多;通过2种染色方法的比较,硝酸银染色方法优于考马斯亮蓝染色方法。优化后的双向凝胶电泳技术得到的图谱,蛋白点多且清晰,重复性好,拖尾现象减少,符合软件分析的要求,可用于口蹄疫病毒感染BHK-21细胞蛋白质组学研究。     

山羊痘病毒的鉴定及序列分析

以华中地区某山羊场疑似山羊痘病料为对象,进行了本动物病例复制、透射电镜观察、病理切片HE染色、特异性目的基因扩增和序列测定及遗传进化关系分析。结果,复制了山羊痘本动物模型,观察到山羊痘病毒(GTPV)样粒子,切片HE染色可见有炎性细胞浸润,病料中扩增到P32基因;序列测定及遗传分析表明,该病毒为山羊痘病毒(ZL/HB/HN),与2008年分离于印度的山羊痘毒株(FJ748488)的遗传关系最近,与中国山羊痘疫苗株(AY881707)及1978年分离于印度的山羊毒株(AY382869)同属一个进化分支。