用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲型标准毒株（ＡＴＣＣＶＲ－２３３２）的ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７的序列,设计合成了一对引物２６３７４ＰＳ／２６３７５ＰＲ,用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术对６株ＰＲＲＳＶ北京分离株进行了检测。结果该引物对６株病毒均能扩增出与预期大小相符的ＲＴＰＣＲ产物,并与ＡＴＣＣＶＲ２３３２株扩增产物的大小相当,而欧洲型标准毒株（ＬＶ株）未获扩增片段。进一步用限制性内切酶进行酶切分析,发现这６株病毒及ＡＴＣＣＶＲ－２３３２的ＰＣＲ产物皆出现相同的限制性酶切图谱,证实６株病毒均为ＰＲＲＳＶ。     

PRRS抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以差速离心法结合蔗糖密度梯度离心法提纯的PRRSVSC2株作为包被抗原,建立了检测猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA法。该法的最适抗原包被浓度为5μg/mL,最佳酶标兔抗猪抗体稀释度为1∶5000,对猪抗PRRSV的IgG检测灵敏度达到0.1μg/mL。该法只与PRRS阳性猪血清呈现阳性反应,而与PRRS阴性猪血清和猪伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪瘟、猪细小病毒病阳性血清呈现阴性反应。应用该法检测PRRSVORF5基因疫苗免疫猪后的抗体消长规律表明,疫苗免疫猪后第7d抗体水平迅速上升,第75d达到高峰,然后缓慢下降,至第135d时仍然极显著(P<0.01)高于空载体对照和空白对照。试验结果表明,该法具有良好的特异性和敏感性,可用于PRRS流行病学调查和PRRSV基因疫苗免疫后抗体水平检测。     

猪生殖与呼吸综合征病毒广东株ORF3和ORF5基因的克隆与分析

采用RT PCR方法扩增了猪生殖与呼吸综合征病毒广东株的糖蛋白基因ORF3、ORF5 ,并对其进行了克隆和序列分析。用Blast分析软件比较分析了其与VR 2 332株以及流行的欧洲株之间的同源性 ,并对其编码氨基酸序列的分子质量、等电点、穿膜区、糖基化位点进行了分析。结果显示 ,PRRSV广东株ORF3与美洲株的同源性达 90 % ,而与欧洲株只是在 318～ 393bp、5 0 2～ 6 97bp之间有 77%左右的同源性 ;ORF5与美洲株的同源性为 88% ,与欧洲株仅在 133～ 2 0 9bp区间有 77%左右的同源性。     

猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。同时用建立的检测方法对组织病料进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达5.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对东莞、增城、湛江等地的猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法与常规RT-PCR检测方法的阳性符合率为100%。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前PRRS的诊断需要。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建及其免疫效果

构建了泛素(ubiquitin,Ub)基因与密码子优化的PRRSV GP5蛋白(optiGP5)基因融合表达质粒pIR-Ub-optiGP5。间接免疫荧光和Western-blot分析表明,重组质粒转染293T细胞后能够瞬时表达。将pIR-optiGP5和pIR-Ub-optiGP5两种质粒DNA肌肉注射免疫BALB/c小鼠后,分别检测小鼠血清中抗GP5抗体、T淋巴细胞的增殖能力以及CTL活性。结果显示,pIR-optiGP5质粒免疫组在二免后可以检测到荧光抗体,而pIR-Ub-optiGP5质粒免疫组一直未检测到抗GP5抗体,但该免疫组的T淋巴细胞增殖指数及针对GP5的特异性CTL反应数值明显高于pIR-optiGP5质粒免疫组。这表明泛素与GP5的融合表达可增强细胞免疫反应。     

猪生殖与呼吸综合征ORF5基因疫苗的构建及其安全性和免疫原性检测

克隆了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SC2株ORF5基因。测序分析表明SC2株属美洲型PRRSV。构建的ORF5基因疫苗经脂质体转染Marc 145细胞后,第26h检测到疫苗蛋白的特异性表达,第56h达到高峰。疫苗肌肉注射小鼠和仔猪后能迅速分布到各组织器官中,未发现核酸疫苗与宿主细胞染色体整合现象;且能使仔猪产生体液和细胞免疫应答,免疫期持续135d以上。结果表明,构建的PRRSVORF5基因疫苗具有良好的安全性和免疫原性。     

广东省猪生殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因的变异分析

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(ATCC VR 2332)基因序列分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF5和ORF6 基因的引物,利用RT PCR从广东省送检的5份病料中均分别扩增得到了大小约787、630 和550 bp的片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD 18 T载体并测序。应用DNAStar软件分析,并与国内外已发表毒株和疫苗株(RespPRRS/Repro、RespPRRS MLV)、LV4.2.1 株的序列进行比较。结果显示,这5 个毒株与CH 1a、HB 1(sh)、BJ 4、ATCC VR 2332、疫苗株等毒株ORF3、ORF5、ORF6 的核苷酸同源性分别为87.2%~98.7%、85.4%~96.8%、91.8%~98.9%,推导的氨基酸同源性分别为84.6%~97.6%、84.5%~95.5%、94.8%~98.9%;而与LV4.2.1株的核苷酸同源性分别为56.1% ~58.3%、54.4%~57.0%、62.2%~64.4%,推导的氨基酸同源性分别为53.9%~56.7%、54.0%~57.0%、78.0%~80.3%。基因系统发育树表明,广东省流行的PRRSV 与HB 1(sh)株的亲缘关系比较近。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建

采用RT PCR技术从长白猪的肌肉组织中扩增出了泛素 (Ubiquitin)基因 ,并将其克隆到 pGEM Teasy载体 ,经测序表明 ,所克隆的基因与GenBank中已登录的序列同源性达 99%。利用设计的融合表达引物 ,分别将泛素基因与猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV )GP5蛋白成熟肽基因进行扩增 ,用重叠区扩增基因拼接法将 2个基因片段进行拼接 ,并插入真核表达载体 pcDNA4 .0HISMAXA中 ,构建出了 pcDNA U GP5重组质粒。     

广西区2008-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的遗传变异分析

为了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,对2008-2011年间来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2基因的扩增和测序分析。结果显示,获得的49个毒株均为美洲型,其中46株具有高致病性变异毒株的序列特征,即其Nsp2蛋白缺失第481位和第533～561位aa,其余3株不具有上述缺失,属于PRRSV传统毒株。广西区49个毒株Nsp2基因间核苷酸序列的同源性介于84.8%～99.7%,与VR-2332、CH-1a、HB-1及JXA1株核苷酸序列的同源性分别为80.5%～83.7%、89.7%～92.6%、92.4%～96.3%、92.8%～99.3%,而与LV株核苷酸序列同源性仅为51.0%～53.9%。基于Nsp2基因核苷酸序列所绘制的遗传进化树,可将所有美洲型PRRSV毒株分为4个亚群,广西区的49个毒株有3株分布在以HB-1株为代表的Ⅲ亚群,46株分布在以JXA1株为代表的Ⅳ亚群。表明,当前广西区PRRSV流行毒株均为美洲型毒株,并且以Ⅳ亚群为优势基因亚群,各毒株间的Nsp2基因序列存在一定的差异,但没有明显的地域特征。     

PRRSV GP3蛋白和PCV-2Cap蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的小鼠免疫试验

为了研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病双价基因工程亚单位疫苗,利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白和猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF3-ORF2,并对该重组病毒进行Western-blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验以及淋巴细胞增殖试验。结果显示,重组杆状病毒表达了重组GP3蛋白和Cap蛋白;该重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP3蛋白和Cap蛋白,并且重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠产生了抗PRRSV和抗PCV-2的特异性抗体,免疫小鼠血清中抗PRRSV和抗PCV-2的中和抗体效价分别达到1∶9.6和1∶13.6。淋巴细胞增殖试验表明,该重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答。结果表明,表面展示PRRSV GP3蛋白和PCV-2Cap蛋白的重组杆状病毒已构建成功,这为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和PCV-2的共感染奠定了基础。