H2O2诱导PC12细胞凋亡前后miRNA的变化及探讨

目的用微小RNA(miRNA)基因芯片技术检测H2O2诱导凋亡的PC12细胞和正常PC12细胞miR-NA的表达谱差异。方法分别以不同浓度的H2O2处理PC12细胞12h,用MTT和流式细胞仪检测处理后细胞的生长活力和凋亡情况;分别提取A(0浓度H2O2处理组)和B(400nmol/LH2O2处理组)PC12细胞的miRNA做miRNA基因芯片检测。结果以A组作为对照,30、50、100、200、400nmol/L的H2O2处理的PC12细胞生存率分别为(92±9.80)%、(90±14.70)%、(80±13.85)%、(54±12.33)%、(22±7.35)%(P<0.01);0、30、50、100、200和400nmol/L的H2O2处理的PC12细胞早期凋亡率分别为2.6%、5.2%、7.2%、10.4%、16.6%、72.2%;在样品A中共筛选出68个有效表达的miRNA分子数据,在样品B中筛选出46个有效表达的miRNA分子数据,两者样品中均检测到有效表达的miRNA分子有39个,其中与样品A相比,在样品B中显著性下调表达的有6个。结论为脑缺血再灌注损伤中神经细胞凋亡的机制和治疗的研究提供了理论依据和新的研究思路。     

OTS-2．2S基因芯片对人脑挫伤后基因表达差异的初步研究

目的利用基因芯片技术,研究人挫伤脑组织中基因表达差异。方法从脑组织提取mRNA,通过OTS-2.2S基因芯片,研究脑挫伤组织与对照脑组织细胞原癌及抑癌相关基因特异性表达差异。结果发现在挫伤脑组织中,HoJ-1和KIAAOO65基因表达水平显著下降,而p107mRNA表达水平显著升高。结论在脑挫伤中仅发现3条基因的表达有显著性差异;本研究是对脑损伤后基因表达水平及其法医学意义进行的探索性研究。     

ARP-SP基因表达谱芯片对脑损伤的初步研究

目的研究脑挫伤后ARP-SRP基因表达谱差异及其法医学意义。方法从脑组织提取mRNA,应用ARP-SRP-1.0S基因芯片,研究脑挫伤组织与对照脑组织细胞凋亡蛋白和应激反应蛋白相关基因特异性表达差异。结果基因芯片杂交结果中,发现人类溶酶体的胃蛋白酶抑制剂不敏感蛋白酶基因(CLN2)表达水平显著下降。结论CLN2基因与一种婴儿致死性神经变性疾病LINCL有关,但CLN2基因在脑损伤中的作用尚有待进一步研究;基因芯片在研究脑损伤后相关基因的改变具有快速、高通量、高敏度等特点。     

用于检测仔猪致病菌的23S rRNA基因芯片的研制

以副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、猪链球菌等12种仔猪致病菌为目标细菌,23SrRNA基因为靶基因,从GenBank中下载其23SrDNA全序列,在其变异区设计特异性探针,在保守区设计通用引物。通过序列分析、PCR靶标与探针杂交试验,建立了有13条寡核苷酸探针和2对通用引物的仔猪常见致病菌基因芯片检测方法。以参考菌株粗提基因组DNA的10倍系列稀释模板做PCR,扩增产物与探针杂交,检出芯片的灵敏度为100fg。对33个参考菌株用芯片检测,结果有1例不正确,只鉴定到属;在61个野外分离株中,55株的芯片检测结果与生化或测序结果一致,有6例不一致,符合率为90%。初步研究证明,该检测方法能快速、有效地鉴定多种仔猪常见致病菌,但要区分某些细菌的致病株与非致病株,还要检测毒力/毒素基因。     

H1N1和H3N2亚型流感病毒基因芯片检测方法的建立

为建立同时能鉴别甲型H1N1和猪流感病毒常见亚型的新型基因芯片检测方法,根据GenBank中已发表的甲型流感病毒MP的基因序列和甲型H1N1(2009)和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型的基因序列,设计、筛选并合成7对特异性引物和1对通用引物;根据扩增的靶序列,设计并合成14条特异性探针和3条质控探针,制备了甲型H1N1(2009)流感病毒和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型基因芯片;并进行了特异性试验、敏感性试验和田间样品的检测。结果显示,该芯片检测方法与猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病毒无交叉反应;对猪H1N1、猪H3N2和甲型H1N1(2009)流感病毒而言,最低可检测到105、104和105稀释的病毒株。结果证实,该方法特异性强、敏感性高,是一种高通量的甲型H1N1和猪流感常见亚型筛查方法。     

布鲁氏菌全基因组DNA芯片研制及比较基因组杂交方法的建立

为利用布鲁氏菌强毒株马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)16M和流产布鲁氏菌(B.abortus)9-941全基因组序列,构建布鲁氏菌全基因组DNA芯片,并将其应用于比较基因组学分析,从基因库下载马耳他布鲁氏菌16M和流产布鲁氏菌9-941中的3 218个基因设计引物,经过条件优化和重新设计引物等方法进行大规模PCR扩增,成功扩增3 212条基因。产物纯化后点制醛基修饰玻片,每个基因2个点,加上阳性和阴性对照,芯片上合计6 912个探针。囊括了布鲁氏菌3 212条基因和阳性、阴性对照点。采用Cy3/Cy5双色荧光杂交技术,分别以马耳他布鲁氏菌16M和流产布鲁氏菌9-941作为参照和待测样本进行荧光双色杂交分析,成功建立了布鲁氏菌比较基因组杂交分析方法。若干质控杂交结果表明,建立的全基因组DNA芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。证明成功建立了基于全基因组DNA芯片的布鲁氏菌比较基因组学技术平台。     

补肾方含药血清处理的大鼠成骨细胞miRNA差异表达

目的 筛选补肾方含药血清干预的大鼠成骨细胞中差异表达的miRNA，为补肾方治疗骨质疏松症提供可供选择的目标miRNA，以探讨其通过调控靶基因表达发挥治疗效应的机制。方法 经细胞性状鉴定的原代大鼠成骨细胞用含药血清干预，采用miRNA芯片检测补肾方含药血清干预3 d与干预1 d的成骨细胞miRNA表达水平，并挑选差异表达2倍以上的miRNA进行定量PCR验证。结果 培养的原代细胞具有典型的成骨细胞性状特征。与对照血清相比，补肾方含药血清干预3 d的成骨细胞共有24个2倍以上表达差异的miRNA，其中上调的16个，下调的8个。差异表达2倍以上的miRNA定量PCR结果与芯片数据一致。结论 补肾方通过成骨细胞中差异表达的miRNA调控靶基因改善骨质疏松症。