猪传染性胃肠炎病毒HN-2012分离株S基因的遗传变异分析及其真核表达

以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)HN-2012株的cDNA为模板,经克隆测序后,将得到的S基因序列及其推导的氨基酸序列与NCBI中不同来源的TGEV毒株的相应序列进行同源性和亲缘关系的比较分析,构建系统进化树进行遗传变异分析;然后将S基因亚克隆至真核表达载体pCAGGS-S-flag中,转染293T细胞进行表达,利用flag标签抗体进行Western-blot分析。结果显示,TGEV HN-2012株的S基因与其他毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.1%~99.1%和93.6%~95.2%,与H株的亲缘关系较近,与我国其他毒株的亲缘关系较远。Western-blot分析中可见大小约为160ku的目的条带,表明S基因成功在293T细胞中表达。本试验结果为深入研究TGEV S蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。     

枯草芽孢杆菌pgsA与猪传染性胃肠炎病毒Sa融合基因的原核表达

为利用原核表达方法使猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Sa蛋白表达在细菌的外表面,对克隆载体pMD18-T-pgsA进行KpnⅠ+BamHⅠ双酶切,将所得片段插入表达载体pET-32a(+)中,构建了重组质粒pET-pgsA,对克隆载体pMD18-T-Sa和重组质粒pET-pgsA分别进行BamHⅠ+HindⅢ双酶切,将Sa片段插入pET-pgsA中,构建重组质粒pET-pgsA-Sa。重组质粒pET-pgsA-Sa经PCR和序列鉴定为阳性后,转化入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,在70ku处出现了与预期大小相符的目的条带。Western-blot试验证实,融合基因pgsA-Sa获得了正确表达,具有良好的反应原性。间接免疫荧光试验证实融合蛋白在大肠杆菌表面获得了表达。结果表明,成功实现了TGEV Sa蛋白在细菌外表面的正确表达,初步鉴定其具有良好的反应原性。本研究为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的克隆及原核表达

从河北省部分地区病猪中分离大肠杆菌,根据GenBank中登录的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术扩增LTB的编码基因,得到一条375bp的片段。将其连入Simple-T载体中,经酶切、PCR及序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化到Rosetta(DE3)感受态细胞中,并用IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot进行分析。结果显示,LTB基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为14ku,与预计的蛋白分子质量大小一致。Western-blot分析表明,该蛋白可以与大肠杆菌免疫血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性,为大肠杆菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

新城疫病毒HN基因在毕赤酵母中的表达及其表达产物的免疫原性

应用RT-PCR获得新城疫病毒(NDV)La Sota株的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因片段,将HN基因片段定向插入毕赤酵母表达载体pPICZaA,构建了分泌型表达载体pPICZaA-HN,将其用Sac I线性化后电转化入P.pastoris X-33.经高抗性及阳性转化子筛选得到重组菌株X-33/pPICZaA-HN,甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE、Western-blot和血凝活性检测,结果约在97 ku处有目的条带.比预期分子质量大,占总蛋白的53%,与NDV阳性血清发生特异性免疫反应,并具有较高的血凝活性.表明,HN基因在毕赤酵母中成功地进行了表达且表达产物具有良好的免疫原性.     

猪圆环病毒Ⅰ型ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)ORF1基因序列,设计合成了1对引物,对PCV1 ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(939 bp)克隆入pMD18-T载体,将筛选获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。测序分析表明,克隆的ORF1与广东分离株DQ659154的核苷酸序列同源性高达99.6%,推导的氨基酸序列同源性为99.4%。将ORF1双酶切产物插入原核表达载体pET-41a,得到的重组子命名为pET-ORF1。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,PCV1ORF1在pET-41a中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为67.6 ku。     

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5(MSP5)基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因。将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析。结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5α宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku。Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株M蛋白基因的克隆及原核表达

构建了TGEV TH-98株M基因序列的原核表达载体,利用RT-PCR方法从TGEVTH-98株中扩增出M蛋白基因,并亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白。结果表明,从TGE TH-98株克隆到了M基因cDNA,该基因全长789 bp,与T014株、Purdue株、TFI株和96-1933株的M基因同源性分别为92.37%、98.35%、99.87%和96.96%。SDS-PAGE电泳结果显示,重组表达质粒获得了约57 ku的目的带,其中M蛋白的分子质量约为31 ku,与预期的结果一致;Western-blotting分析表明,融合表达产物可与TGEV全病毒制备的阳性血清发生反应。证实,TGEV的M基因高度保守,构建的M基因原核表达载体pGEX-6P-TM能在大肠埃希氏菌中获得高效表达。     

小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株F基因的克隆与原核表达

提取小反刍兽疫病毒(PPRV)疫苗株Nigeria 75/1的总RNA,用RT-PCR方法扩增F基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒为模板克隆去掉N端信号肽和跨膜区的F基因(F-1)并亚克隆于原核表达载体pET-30a(+),得到重组质粒pET30-F-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫SPF家兔制备抗体,进行间接免疫荧光检测并用ELISA测定抗体效价.结果显示,目的基因正确插入了表达载体,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,用重组蛋白免疫3次后,兔血清抗体达到较高水平,Western-blot分析说明表达产物能够与兔血清抗体发生特异性反应,间接免疫荧光试验显示重组蛋白免疫兔阳性血清能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.表明,重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达,并且具有较好的反应原性.     

番鸭呼肠孤病毒YB株NS基因的序列分析及原核表达

为实现番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株NS非结构基因的克隆分析及原核表达,首先经RT-PCR扩增NS基因的完整编码序列(CDS),并将其克隆到p ET-32a(+)载体中。测序后对获得的NS基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。测序结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株NS基因的原核重组质粒p ET-YB-NS,并获取了NS基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB NS基因的CDS大小为1 908 bp,编码635个氨基酸;该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为98.2%~99.4%。遗传进化树分析显示,MDRV-YB株处于传统型MDRV分支上。该蛋白氨基酸序列中并不含有潜在的信号肽序列,但是含有2个潜在的N-糖基化位点以及61个磷酸化位点。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,成功高效表达出分子质量约为88.7 ku的融合蛋白(p-NS),表达时IPTG最佳诱导时间、浓度和温度分别为5 h、0.4 mmol/L和36℃。Western-blot结果显示,表达的p-NS蛋白能特异性识别MDRV阳性血清,表明表达产物具备良好的反应原性。上述结果表明,MDRV NS非结构基因的克隆分析及其蛋白表达的实现,为进一步研究MDRV NS蛋白功能奠定了基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的扩增与克隆

应用RT PCR方法扩增出猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的核衣壳蛋白基因 (N基因 ) ,并将其克隆到 pET 32a载体 ,构建了高效原核表达载体pETN。将 pETN重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌后 ,对插入片段进行了序列测定及同源性分析。结果表明 ,插入片段序列与PRRSV美洲型ATCCVR2 332株的ORF7核苷酸序列同源性达 99.9% ,与分离毒株的同源性达 99.0 %。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

pIRES2-EGFP-LR真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

为探讨层黏蛋白受体的生理功能及其在疾病发生、发展过程中的作用,以培养的SD大鼠大脑皮质神经元的总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增了SD大鼠层黏蛋白受体基因.将其克隆到pMD18-T载体中,经酶切纯化后再将其亚克隆到带有加强型绿色荧光蛋白报告基因的pIRES2-EGFP真核表达栽体中,对重组质粒pIRES2-EGFP-LR进行酶切和测序鉴定后,采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到293T细胞,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其表达情况.结果表明,真核表达载体plRES2-EGFP-LR构建成功并可以在293T细胞中表达.该表达载体可以作为研究层黏蛋白受体生理功能的重要工具.     

长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。     

多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清7型25-4株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜蛋白(OMP)基因特异片段,并克隆于pMD 18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1,成功构建了重组表达载体pGEX-omp;以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),经SDS-PAGE鉴定,表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku,命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解,获得切掉标签的OMP。经ELISA检测,该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应,具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APPOMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。     

锦鲤疱疹病毒CJ株ORF83基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF83蛋白的结构特征和进化关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF83基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF83基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统进化树。结果显示,获得了长687 bp的ORF83基因,编码229个氨基酸;编码蛋白的理论分子质量为25 822.18 u,等电点为8.600;疏水性为-2.733～3.100;信号肽切割部位最可能位于第22位的G(甘氨酸)和第23位的V(缬氨酸)之间;跨膜结构分析表明,ORF83有4个跨膜区;抗原表位预测显示,编码蛋白的抗原性良好;结构预测显示,ORF83可能存在1个N-糖基化位点、11个O-糖基化位点和13个磷酸化位点;系统进化树分析显示,KHV-CJ株与锦鲤疱疹病毒美国株和以色列株属同一分支。结果表明,ORF83基因编码的蛋白可能具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体。     

鸭源H9N2亚型流感病毒NS基因的克隆及表达

根据GenBank中收录的H9N2亚型流感病毒的NS基因序列设计合成了 1对引物NSU/NSL ,利用RT PCR扩增出了H9N2株NS基因 ;将该基因片段克隆到 pMD 18 T载体上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果 ,获得了NS基因片段的阳性重组子 ,扩增的NS基因包含NS1基因完整的阅读框架和部分NS2基因 ,其序列与GenBank中收录的其他分离株NS基因比较 ,同源性达 96 %～ 99%。再将克隆的NS基因插入到原核表达载体 pET 2 8a后 ,转化E .coliBL2 1(DE3)感受态细胞 ,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达 ,所表达蛋白质的分子质量约为 30ku。     

结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析

以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。     

鹅细小病毒vp1基因的原核表达及抗原性分析

将鹅细小病毒(GPV)H1株vp1基因从pMD18T-vp1亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1的多克隆位点,构建了原核表达载体pGEX-6P-vp1,将其转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了108ku的融合蛋白,该融合蛋白经亲和层析纯化并经Western-blot检测。结果表明,纯化的融合蛋白可与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。