牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法的建立

为建立一种适用于基层兽医实验室特异、敏感、快速检测牛巴贝斯虫感染的方法,以牛巴贝斯虫球状体蛋白4(SBP4)基因为靶基因设计引物,建立检测牛巴贝斯虫的巢式PCR方法。结果表明,该方法可特异性地检测牛巴贝斯虫感染,与14种动物梨形虫无交叉反应。该方法能够检测到1 copy的SBP4基因,其敏感性分别是对应的内、外引物普通PCR的10倍和1 000倍。应用该巢式PCR方法,对田间随机采集的136份野外样品进行检测,检出阳性样品9份,显著高于AbouLaila等报道的方法(5份)。这些数据表明,建立的巢式PCR方法可用于基层兽医实验室敏感、准确地检测牛巴贝斯虫感染。     

对虾白斑综合征病毒LAMP检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28的基因序列设计合成4条特异性引物,以pMDT-VP28重组质粒为标准模板,通过优化反应体系和反应条件,建立了WSSV的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,测定LAMP对WSSV-DNA的最低检测限,并与巢式PCR进行了比较。结果显示,该LAMP方法的最佳反应温度为65℃,反应时间为60min;LAMP对WSSV的最低检测限为10copies/μL,而巢式PCR为100copies/μL,表明该LAMP方法的敏感性显著高于巢式PCR检测方法。因此,WSSV的LAMP检测方法比PCR更为简便、快速、灵敏,且无需昂贵的变温仪器,更适应水产养殖的现地检测,本研究为WSSV早期感染的快速检测提供了新方法。     

三种致奶牛流产病原多重巢式PCR检测方法的建立

为同步检测引起奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原,本研究分别设计针对新孢子虫ITS1基因(Nc-ITS1)、布氏杆菌16S rRNA基因(Ba-16S rRNA)及弓形虫529 bp重复序列基因(Tg-529 bp)的特异性巢式PCR引物,建立并优化了能够同时检测这三种病原的多重巢式PCR方法。结果显示,多重巢式PCR对Nc-ITS1、Ba-16S rRNA及Tg-529 bp扩增产物的大小分别为601 bp、380 bp、245 bp。外引物退火温度为57℃,内引物为53℃;Taq酶、dNTP和Mg2+浓度分别为1.0 U、2.0 mmol/L和1.0 mmol/L;Nc-ITS1和Tg-529 bp外、内引物浓度均为0.4 m ol/L,Ba-16S rRNA为0.2 mol/L。该多重巢式PCR对Nc-ITS1和Ba-16S rRNA检测敏感性达3×102 copies/L,对Tg-529 bp达3×101 copies/L,对住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌扩增均无目的条带,表明该多重巢式PCR方法具有良好的敏感性和特异性。利用该方法对86份临床样品进行检测,结果显示新孢子虫阳性样品26份,布氏杆菌阳性样品2份,弓形虫阳性样品1份,其中新孢子虫和布氏杆菌均为阳性的样品1份,与单巢式PCR检测结果一致。结果表明,建立的多重巢式PCR方法可以用来对致奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原进行快速、准确地检测。     

猪传染性胃肠炎病毒半巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种高效、敏感、特异的用于检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的半巢式RT-PCR方法,本研究依据GenBank发表TGEV的N基因序列设计3条特异性引物,通过优化反应体系,建立了检测TGEV的半巢式RT-PCR方法,并对反应体系特异性和敏感性进行了检测。结果显示,该方法能够成功扩增483 bp和338 bp两条目的条带;对TGEV具有良好的特异性,与猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪德尔塔冠状病毒均无交叉反应;最低可检测到1.86×10~(-1)pg/μL的TGEV cDNA。用所建半巢式RT-PCR对临床50份猪腹泻样品进行检测,结果显示,阳性率为36%,高于普通RT-PCR阳性检出率,且阳性样品符合率为100%。本试验所建立的半巢式RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性好,可准确地对TGEV感染做出诊断,为TGEV的临床检测、流行病学调查提供了有效手段。     

小鼠诺如病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在利用巢式RT-PCR技术,建立高效检测小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的方法。通过Gen Bank上公布的一系列小鼠诺如病毒的基因序列,设计内、外各一对特异性引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式RT-PCR检测方法,并对临床样品进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法特异性好,最低检出量为1×102copies/L,高于使用参考引物RT-PCR的最低检出量1×105 copies/L,对临床样品检出率为73%,高于使用参考引物普通RT-PCR的检出率(60%),与RT-qPCR方法检出率一致。结果表明,本研究成功建立了一种检测小鼠诺如病毒的巢式RT-PCR方法,并能快速、高效地应用于临床样品的检测,为小鼠诺如病毒的诊断和检测提供了有力的手段。     

猪脑心肌炎病毒SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

针对猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因序列设计并合成了l对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测EMCV核酸的SYBR Green I real-time PCR方法.检测结果显示,该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.991;对初始模板的检出下限为1×101copies/μL,比常规PCR方法高100倍;与其他猪源病毒,如口蹄疫病毒(FMDV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于3%.应用建立的方法检测了17份临床可疑病例的心、脑组织样本,结果1份为阳性.表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于EMCV的病原检测及定量分析.     

丝状霉形体山羊亚种巢式PCR检测方法的建立

根据已发表的丝状霉形体簇各成员核苷酸序列,设计合成了2对引物McF、McR和MmcF、MmcR,建立了可以鉴别丝状霉形体山羊亚种(Mycoplasma mycoidessubsp.capri,Mmc)的巢式PCR方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法只能对Mmc扩增出195 bp的片段,而对其他病原菌不能扩增出任何条带,它最低能够检测出10 pg的Mmc DNA,说明该方法具有良好的特异性和很高的敏感性。田间试验结果显示,对4株霉形体分离株及其病料均可扩增出Mmc特异性片段,表明,该巢式PCR方法可用于Mmc快速鉴定和流行病学调查。     

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apx Ⅳ A基因3'端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法.筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果.结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠.应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率.     

鹌鹑源性成分PCR检测方法的建立

根据GenBank中的鹌鹑线粒体DNA(mtDNA)12sRNA基因保守序列,用Primer5.0软件设计了1对针对鹌鹑的特异性扩增引物,建立了一种检测鹌鹑动物源性成分的PCR方法.通过聚合酶链式反应(PCR)从鹌鹑肉和鹌鹑肉骨粉样品中扩增到了235 bp的目的片段,而参考物种鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、鱼和空白对照则无目的片段,说明该引物只对鹌鹑有特异性.测序结果表明,鹌鹑组织PCR产物的核苷酸序列与GenBank中检索到的相应序列相吻合;该方法的检测灵敏度为1 g/kg.     

牛结核病巢式PCR快速检测方法的建立

根据分枝杆菌(mycobacteria)保守的插入序列IS1081设计4条特异性引物,建立了快速检测牛结核病的巢式PCR方法。该方法一次扩增的敏感性是1.35 pg,二次扩增的敏感性是1.35 fg。在对95份PPD阳性牛临床病料组织和23份血液样本的PCR检测中,用引物TB-Q1和TB-Q2做一次扩增,阳性检出率分别为36/95(37.5%)和5/23(21.7%);用引物TB-B1和TB-B2做二次扩增,阳性检出率分别为81/95(85.3%)和14/23(60.9%)。该方法作为辅助PPD试验的快速检测方法用于牛结核病的流行病学调查,具有重要的实用价值和应用前景。     

重庆市山羊博尔纳病病毒P24基因的检测

为了解重庆市山羊博尔纳病隐性带毒情况,分析博尔纳病病毒(BDV)的种系来源。采用巢式逆转录酶PCR结合荧光定量PCR(FQ-nRT-PCR)技术对重庆市60只山羊外周血单核细胞 (PBMCs)及脑组织中的BDV P24基因片段进行了检测,将阳性产物测序,并与国外BDV毒株进行了比较。结果,山羊外周血检测阳性率为8．3％(5／60),脑组织检测阳性率为10％(6／60)。该 BDV P24片段核苷酸序列与马源BDV H1766株同源性最高,达96．51％,与标准株Strain V和 He／80同源性为95．35％,并且编码的氨基酸序列也相同。表明,重庆市山羊中存在动物源性博尔纳病隐性带毒。该BDV P24核苷酸序列与Strain V和He／80株具有高度同源性。     

鸡传染性喉气管炎TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的快速诊断方法,基于ILTV g B基因设计特异性探针和引物,建立一种基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。结果显示,ILTV qPCR方法的标准曲线为y=-3.892 9x+44.607,线性相关值(R²)为0.998 8。该方法的最低检测限为1.0×10 copies/μL,批内与批间重复性检测的变异系数均小于5.64%,且与其他鸡源病原体无交叉反应。临床样本检测结果显示,该qPCR方法的检测阳性率为98.7%,而普通PCR的检测阳性率为92.61%。以上结果表明,该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于ILTV的疫病监测和流行病学调查,为ILTV感染的预防和诊断提供了有力工具。     

牛霉形体PCR检测方法的建立

参考GenBank中牛霉形体和无乳霉形体P81基因的序列差异,设计了针对牛霉形体P81基因的PCR引物,建立了牛霉形体PCR检测方法.并对该方法进行了敏感性和特异性试验.该方法可以从100ccu/mL(ccu:color change unit,颜色变化单位)的牛霉形体培养物中检出目的片段;经对丝状霉形体丝状亚种SC型(MmmSC)PG1株、丝状霉形体丝状亚种LC型(MmmLC)Y-goat株、山羊霉形体山羊亚种(Mccp)87001株、无乳霉形体(M.agalactiae)PG2株、绵羊肺炎霉形体Y-98株等亲缘关系相近的霉形体纯培养物检测,结果证实该方法具有良好的特异性.利用建立的PCR检测方法可以从人工感染牛的鼻拭子和临床发病牛肺中扩增出目的片段,与分离培养结果完全符合,本方法为国内首次建立的敏感、特异、快速的牛霉形体PCR检测方法.     

张家川县绵羊血液原虫病的调查与防治

对甘肃省张家川县绵羊蜱媒血液原虫病进行了流行病学调查。结果发现 ,绵羊体表寄生蜱类 5种 ,即青海血蜱 (Haemaphysalisqinghaiensis)、长角血蜱 (H .longicornis)、革蜱 (Dermacentorspp .)、草原革蜱 (D .nuttalli)和微小牛蜱 (Boophilusmicroplus) ,其中青海血蜱为传播媒介优势种。绵羊泰勒虫 (Theileriaovis)感染率为 6 2 .2 % ,无形体 (Anaplasmaovis)感染率为 16 .7% ,且有双重感染的病例。体表喷洒药物灭蜱试验表明 ,5 0mg/L倍特对蜱类的半数致死时间 (LT50 )为 4 .91h ,用药后 3d体表残留活蜱数为 3.4± 2 .2只 ,14d后再次染蜱数为 4 9.7± 12 .0只 ,羊只血液原虫病感染率由38.1%降至 8.8% (P <0 .0 1) ,红细胞染虫率由 11.6 %± 6 .9%降至 5 .4 %± 2 .1% (P >0 .0 1)。     

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒(CaPV)末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法.结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性.与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性.表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测.     

O157:H7型大肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的肠出血性大肠杆菌保守基因序列Stx1、Stx2设计合成荧光定量PCR引物和探针,对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床分离病料进行了检测,并与常规PCR方法的检测结果做了对比.结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的灵敏度达7.06×103CFU/mL,比常规PCR方法的灵敏度高106倍.用该方法和常规PCR对8种样品进行了检测,证实,该方法与常规PCR的阳性符合率为100%,具有较好的重复性.     

miR-275在长角血蜱不同发育阶段及组织中表达的动态变化

根据本实验室建立的高通量测序数据库中长角血蜱miR-275的成熟体序列信息,设计出特异性茎环引物及PCR扩增引物,同时以长角血蜱β-actin基因(GenBank登录号:AY254898)为内参基因,绘制标准曲线,计算长角血蜱miR-275的标准拷贝数,采用GraphPad Prism 5软件分析miR-275在长角血蜱不同发育时期及不同组织中的表达情况。结果显示,长角血蜱miR-275和β-actin标准曲线的回归系数均大于0.99,熔解曲线峰值单一,Ct值的变异率均小于5%,表明引物特异性好,标准曲线重复性和稳定性高。用real-time PCR方法对miR-275在长角血蜱卵的不同发育时期、蜱不同发育阶段及不同组织中的表达情况进行分析。结果显示,miR-275在长角血蜱卵发育到第16天的拷贝数最大,为(13.07±1.63)×106 copies/μL,是表达量最低的第5天的43.57倍;在饱血成蜱中拷贝数最多,为(18.95±1.55)×106 copies/μL,是饥饿成蜱的236.88倍;长角血蜱卵巢中拷贝数是最高的,为(15.29±3.59)×106 copies/μL,是表皮表达量的10.47倍。结果表明,miR-275在长角血蜱卵的发育、细胞增殖、组织分化等过程中可能起到了至关重要的作用。     

猪源伪狂犬病病毒gB基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为加强对猪源伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的监测,在PRV gB基因的保守区设计特异性引物,并建立了检测猪源PRV的实时定量PCR。该方法可检测PRV的最低TCID50为2×101/mL,比伪狂犬病诊断技术国家标准中的PCR方法敏感100~1 000倍,且特异性、重复性好。利用该方法测定了PRV SC株在感染Vero细胞后的复制动态;结果显示,PRV在感染后第12小时进入复制高峰期,在感染后第24小时达到平台期。本方法具有快速、敏感和重复性好等特点,能够为研究病毒的复制动态或临床样品的检测提供技术支持。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,并将其应用于临床样品FHV-1的快速检测。根据GenBank已发表的FHV-1 TK基因序列的保守区域设计合成1对引物,通过对反应体系的优化,建立了FHV-1 PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、稳定性。结果显示,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法对猫杯状病毒(FCV)、猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)均无交叉反应;可检测病毒DNA模板的最低浓度为3.78×101copies/μL;应用该方法从22份猫临床样品中检出17份FHV-1核酸阳性样品。上述结果表明,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法特异、灵敏、快速、可重复,适合于临床FHV-1的快速检测。