牛诺如病毒和牛嵴病毒及牛环曲病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为了解牛诺如病毒(BNo V)、牛嵴病毒(BKV)和牛环曲病毒(BTo V)在国内的流行情况,本研究参考Gen Bank中登录的BNo V Rd Rp基因、BKV 3D基因和BTo V N基因保守区域,设计3对特异性引物,成功建立了能够同时快速检测BNo V、BKV、BTo V的三重RT-PCR方法。该方法特异性较强,仅对BNo V、BKV、BTo V扩增出特异性条带,对其他5种常见引发犊牛腹泻的病毒均未扩增出条带;敏感性较高,针对p MD18-T-BNo V、p MD18-T-BKV和p MD18-T-BTo V质粒标准品的最低检测限分别为2.73×10⁴ copies/μL、2.87×10⁴copies/μL、3.18×10³copies/μL;重复性好,同批次样品的3次检测结果均一致。使用该方法对153份临床样品进行检测,结果显示,BNo V、BKV、BTo V的阳性率分别为11.11%、25.49%、38.56%,3种病毒混合感染率为7.18%。与其他学者建立的单一RT-PCR检测方法相比,符合率分别为94.77...     

猪乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×10¹～7.2×10⁸ copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×10⁰copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。     

禽多瘤病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)的快速诊断方法,根据APV VP4基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,验证了其特异性、敏感性和重复性,并利用建立的方法对采集的临床样本组织进行检测。结果显示,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1.0×10⁹～1.0×10²copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.021,检测下限为1.0×10¹copies/μL,与其他禽源病毒未发生交叉反应,重复性试验的变异系数均小于2%,重复性好,并且该方法在实际临床检测中可行。上述结果表明,建立的方法可用于禽多瘤病的早期诊断和APV快速检测。     

中蜂囊状幼虫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立与应用

通过RT-PCR方法在云南中华蜜蜂体内检测中蜂囊状幼虫病毒(CSBV),该病毒主要以AmSBV-YN(GenBank ID:KX819276.1)病毒株的形式存在。为了精确鉴定、快速检测中蜂囊状幼虫病毒,根据AmSBV-YN的CDS保守区域,设计合成特异性引物并建立相对应的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的标准曲线循环域值(C_t)与标准品模板浓度在2.34×10²～2.34×10⁹copies/μL间的线性关系良好,相关系数R²为0.994,斜率为-3.118。该方法与蜜蜂残翅病毒、黑蜂王台病毒、蜜蜂以色列急性麻痹病毒不发生交叉反应,表明该方法特异性强;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于3%。所建立的荧光定量PCR方法对中华蜜蜂样品的检测结果显示,阳性率达90.0%,高于常规PCR方法的检测阳性率73.3%,说明该方法具有良好的适用性。结果表明,该方法可应用于对中蜂囊状幼虫病毒的快速检测,为中蜂囊状幼虫病的及时防控提供了有力的技术支持。     

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

牛支原体牛多杀性巴氏杆菌与牛传染性鼻气管炎病毒三重PCR方法的建立与初步应用

为建立一种可同时检测牛支原体(MB)、多杀性巴氏杆菌(PM)与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的三重PCR检测方法,笔者设计1对特异性引物,引用文献的2对引物,对反应条件与反应体系进行优化,建立了一种三重PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果显示,最佳退火温度为51.7℃,最佳引物终浓度均为0.5μmol/L;敏感性结果显示,MB、PM、IBRV的最低检出限分别为3.9×10^-3ng/μL、6.61×10^-2ng/μL与2.97×10^-2ng/μL;特异性结果显示该方法只能特异性检测出MB、PM和IBRV。利用建立的三重PCR方法对108份临床病料进行检测,结果与单一PCR一致。结果表明,该方法可用于临床快速检测MB、PM、IBRV。     

猪库布病毒纳米PCR快速检测方法的建立

为了给临床检测猪库布病毒(PKV)提供更加准确便捷的检测方法,本试验设计了1对特异性引物,扩增PKV基因组的VP0区域。在传统PCR反应体系中添加纳米金颗粒材料,优化后建立了一种方便快捷且特异检测PKV的nano-PCR方法。结果显示,该方法能特异性扩增猪库布病毒,与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒均无交叉反应。nano-PCR相对于普通PCR表现出更高的敏感性,普通PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-7ng/μL,而nano-PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-10ng/μL,敏感性提高了1 000倍。对来自不同发病猪场30份腹泻猪的粪便和血液临床样本的检测结果显示,nano-PCR阳性检出率为23.33%(7/30),普通PCR阳性检出率为16.66%(5/30)。结果表明,本试验建立的nano-PCR方法在猪库布病毒的检测中表现出更高的特异性和敏感性,对猪库布病毒的快速诊断和检测具有重要的临床意义。     

鹅肾型星状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测鹅肾型星状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据鹅肾型星状病毒的ORF1b保守序列,设计出1对引物,建立了检测该病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的Ct值与标准质粒在2.42×10^4~2.42×10^9copies/μL范围内呈良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为24.2 copies/μL;该方法特异性强,对禽流感H9N2、鹅副黏病毒、鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于2.5%。运用该方法对动物回归试验中攻毒的雏鹅的各脏器进行检测,结果显示,肾、脾和肝中病毒含量较高,其次是胰腺、肺及肠道,而心和脑中的病毒含量最低。上述结果表明,本研究成功建立了鹅肾型星状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并根据此方法检测出该病毒对肾、脾及肝具有较强的亲嗜性,为该病原致病机制研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪伪狂犬病病毒(PRV)gD和猪细小病毒(PPV)VP2基因保守区域,设计了特异性引物,在分别建立单一病毒基因PCR检测方法的基础上,通过对3组引物的比例和浓度、dNTPs和Mg2 浓度、退火温度等条件的优化,建立了针对上述3种病毒的三重PCR检测方法。敏感性试验表明,应用该方法最低可检测到4×10-4ng/μL的PRV双链DNA模板和2×10-5ng/μL的PCV2和PPV单链DNA模板。对21份自然感染病猪样品的检测结果表明,该三重PCR检测结果与单一PCR检测的结果完全符合。试验结果显示,建立的三重PCR方法可用于3种DNA病毒的同时检测,具有快速、准确的特点,有临床应用前景。     

痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×10^9~7.58×10^2copies/μL范围内呈良好线性关系,R^2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性。临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高。结果表明,建立的痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段。     

阿卡斑病毒荧光RT-RAA快速检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测阿卡斑病毒(AKAV)的分子生物学检测方法,本研究通过比较分析AKAV基因组序列,在S基因保守序列区域设计重组酶介导等温扩增(RAA)引物及探针,筛选最佳引物对,然后对RAA反应温度、引物浓度以及探针浓度进行优化,建立了AKAV的荧光逆转录重组酶介导的核酸等温扩增(RT-RAA)快速检测方法。结果显示,所建立的荧光RT-RAA方法在42℃反应20 min即可快速检测出AKAV,检测下限可达6.26×10¹copies/μL,与牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等无交叉反应,并具有良好的重复性。对37份临床样品进行检测,阳性检出率为43.24%,与RT-qPCR检测结果符合率为94.59%。结果表明,建立的AKAV荧光RT-RAA快速检测方法具有快速、特异、灵敏、稳定等特点,可为AKAV的现场快速检测提供可靠方法。     

猪凸隆病毒猪嵴病毒猪捷申病毒猪轮状病毒多重荧光RT-PCR方法的建立与初步应用

为建立一种同时检测猪凸隆病毒、猪嵴病毒、猪捷申病毒和猪轮状病毒的高特异性、高灵敏性的检测方法,根据这4种病毒的保守基因序列分别合成相应的特异性引物及TaqMan探针,采用One-Step法进行反应体系的优化,建立多重荧光RT-PCR方法,评估该方法的特异性、敏感性、重复性,并用于本地猪场腹泻样品中上述4种病毒的流行病学调查。结果显示：该方法特异性好,可特异性地检测上述4种病毒的单一模板及混合模板,其他对照株均无扩增信号;灵敏度高,上述4种病毒的最低检出限均为10¹ copies/μL;重复性好,批内及批间重复试验变异系数均小于3%。所建立方法还具有高通量、低污染和操作简便的优点,3 h内即完成全市猪场265份腹泻样品的检测,大大提高了检测效率。流行病学调查显示,厦门市养猪场猪嵴病毒、猪捷申病毒、猪轮状病毒和猪凸隆病毒这4种病毒均具有较高的检出率,阳性率依次为67.92%、65.28%、36.60%和27.55%。该研究将为猪腹泻病鉴别诊断及防控提供重要的技术支持。     

奶牛乳房炎三种主要链球菌多重PCR检测方法的建立

链球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原菌,其中无乳链球菌(S.agalactiae)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)和乳房链球菌(S.uberis)是奶牛乳房炎主要的致病性链球菌。为同时、快速地检测牛奶样品中这3种重要链球菌,本研究根据无乳链球菌sip基因、停乳链球菌Mig基因及乳房链球菌pauA基因设计特异性引物,同时以细菌16S rRNA基因为内参,建立了多重PCR检测方法,并进行条件优化。结果显示,该方法最佳退火温度为58℃,最佳扩增循环数为25个循环,本方法同时检测无乳链球菌、停乳链球菌及乳房链球菌时,检测限分别为1×10³CFU/m L、1×10³CFU/m L及1×10⁴ CFU/m L,灵敏性高。该方法对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌等10种菌均无交叉反应,特异性好。模拟样品结果显示,当奶样中3种菌的初始浓度均为1 CFU/m L时,37℃增菌6 h即可检出乳房链球菌,增菌8 h以上3种菌可全部检出。结果表明,该多重PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏性,对同时快速检测...     

猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能够准确、快速地鉴别猪肠病毒G型的诊断方法,本研究参考猪肠病毒G型的3D基因序列设计1对特异性引物,扩增片段预计大小约为104 bp,将3D基因片段克隆到pMD18-T载体上的阳性重组质粒作为标准品,建立猪肠病毒G型的实时定量PCR检测方法,并应用到临床样品的检测。研究结果显示,该方法设计的引物具有高度的特异性;标准曲线的Cq值与质粒标准品模板在2.92×10^8copies/μL^2.92×10^2copies/μL范围内,呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-4.023;组内与组间重复性试验显示变异系数很小,在0.26%~1.57%之间。该方法的最低检测限量可达2.92×10 copies/μL。使用本方法对2017-2019年广西部分地区的猪场临床腹泻粪便样品进行检测,猪肠病毒G型阳性检出率为18.42%,说明广西部分地区的猪场存在猪肠病毒G型的感染。本研究成功建立了猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法,可用于猪肠病毒G型感染的临床检测。     

猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的方法,本研究根据GenBank上登录的FHV-1 UL55序列设计特异性探针及引物,筛选最佳引物对,建立了FHV-1的重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。该方法在39℃反应20 min即可快速、特异性地检测FHV-1。灵敏性试验结果显示,RAA最低检测限为7.60×10¹ copies/μL,比普通PCR最低检测限高100倍。特异性试验结果显示,该RAA方法与猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫细小病毒无交叉反应。对34份临床样本进行检测,其中13份为阳性,阳性检出率为38.23%。综上所述,本研究成功建立了猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法。     

蓝舌病病毒10型和20型及23型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV 10型696 bp、BTV20型293 bp和BTV 23型356 bp三条特异性的片段,对BTV其他基因型以及小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)的核酸均无扩增;该方法最低可检测1.696×103copies/L的BTV10、1.375×103copies/L的BTV20和1.317×103copies/L的BTV23。利用建立的多重RT-PCR方法对67份临床样品进行检测,结果与OIE推荐的BTV套式RTPCR方法符合率为100%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法特异性好,具有较强的检测敏感性,可用于蓝舌病病毒血清型的鉴别。     

牛冠状病毒牛肠病毒牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法的建立与应用

为建立一种可以快速检测牛冠状病毒（BCoV）、牛肠病毒（BEV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光PCR方法并应用于临床检测,根据BCoV N基因、BEV 5′-UTR基因、BVDV 5′-UTR基因设计3对特异性引物和探针,通过对引物、探针的浓度以及反应条件的优化,建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法,并对该三重PCR方法的敏感性、重复性、特异性和临床样本检测结果进行了评价。结果显示,该方法灵敏度高,对BCoV、BEV和BVDV的最低检测限为10 copies/μL;重复性稳定,批内和批间变异系数（CV）均在2%以下;特异性强,对常见腹泻类病原无交叉反应。应用此方法检测河南省445份牛腹泻粪便样本,BCoV、BEV和BVDV的阳性率分别为6.5%(29/445)、17.5%(78/445)、12.1%(54/445)。上述结果表明,本研究建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒一步法三重实时荧光PCR方法,为疫病的快速检测及预防提供了有效的技术手段。     

非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速诊断方法,本研究根据ASFV SY18株p17蛋白的编码基因D117L的保守序列设计并合成引物和探针,建立了基于ASFV p17蛋白的编码基因D117L的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1×10^9~1×10^1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.192,检测下限为10 copies/μL,且与其他能引起相似症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.920 7%,重复性好。此方法可用于ASF的早期诊断和ASFV快速检测。     

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10~2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10~4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。     

小鼠诺如病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在利用巢式RT-PCR技术,建立高效检测小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的方法。通过Gen Bank上公布的一系列小鼠诺如病毒的基因序列,设计内、外各一对特异性引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式RT-PCR检测方法,并对临床样品进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法特异性好,最低检出量为1×102copies/L,高于使用参考引物RT-PCR的最低检出量1×105 copies/L,对临床样品检出率为73%,高于使用参考引物普通RT-PCR的检出率(60%),与RT-qPCR方法检出率一致。结果表明,本研究成功建立了一种检测小鼠诺如病毒的巢式RT-PCR方法,并能快速、高效地应用于临床样品的检测,为小鼠诺如病毒的诊断和检测提供了有力的手段。