性别控制胚胎玻璃化一步法稀释冷冻保存技术的研究

为了创立在用户庭院就能应用的玻璃化保存性别控制胚胎的冷冻剂稀释处理方法,采用细管内3种不同液体层构成(A、B、C)法,对新鲜分割胚一步法稀释后的存活能力进行了研究;其次用特定细管最小容量冷却法与上述3种不同液体层构成中效果较好的B法对玻璃化冷冻溶解的新鲜分割胚、体外受精分割胚及冷冻溶解的体外受精分割胚进行一步法稀释后的存活能力予以对比。结果,3种不同液体层构成间胚胎的存活能力无显著差异,B法较高;应用特定细管最小容量冷却法在冷冻溶解的新鲜分割胚、体外受精分割胚及冷冻溶解的体外受精分割胚一步法稀释后的存活能力均显著高于B法。结果表明,特定细管最小容量冷却法是更有效的保存方法。     

不同化学激活剂对小鼠卵母细胞的激活效果

为探讨不同激活剂的卵母细胞孤雌激活效果及激活胚体外发育情况,用乙醇、Ca-A23187、SrCl2、6-DMAP及CB分别对小鼠卵母细胞进行了激活处理。结果显示,70 mL/L乙醇刺激小鼠卵母细胞时,以激活5~7 min的激活效果及孤雌胚发育较好,桑囊胚发育率可达29.11%;用SrCl2激活小鼠卵母细胞时,6~10 mmol/L为最佳处理浓度,3~6 h为最佳激活时间,桑囊胚发育率可达16.67%;以70 mL/L乙醇激活5 min,再用2 mmol/L 6-DMAP 5μg/mL CB激活3 h效果最佳,桑囊胚发育率高达35.77%。研究证实,小鼠卵母细胞经乙醇、6-DMAP和CB等复合激活后能较好地发育。     

二甲苯对小鼠卵巢组织损伤的研究

为了研究二甲苯对小鼠卵巢组织的损伤作用,以健康成年SD雌性小鼠作为实验动物,分3个试验组(低、中、高剂量组)和1个对照组,试验组腹腔注射不同剂量(按体重0.125、0.25、0.5mL/kg)的二甲苯,对照组每天腹腔注射生理盐水。采用石蜡切片和HE染色技术观察二甲苯染毒后小鼠卵巢组织结构的变化;采用分光光度法测定小鼠卵巢组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)含量。结果表明,二甲苯染毒导致小鼠卵巢发生萎缩,中、高剂量组的卵泡内都有黑色颗粒,且随二甲苯剂量的增加其病理变化更加明显;中、高剂量组卵巢组织的SOD活性与对照组相比显著下降,而MDA含量显著升高。证实,二甲苯对卵巢组织具有明显的损伤作用,且表现出明显的剂量效应。     

玻璃化冷冻对猪GV期卵母细胞及其DNA的影响

为了探索对猪GV期卵母细胞低毒性以及冷冻效果好的最佳冷冻保护液,并对玻璃化冷冻卵母细胞及其DNA损伤进行评价,本研究以猪GV期卵母细胞作为试验材料,应用玻璃化冷冻方法,就目前应用最多的六种冷冻保护液进行筛选,筛选出最合适的冷冻保护液;透射电镜观察冷冻卵母细胞超微结构的变化;采用彗星电泳技术检测玻璃化冷冻对卵母细胞DNA的影响。结果发现,以二甲基亚砜DMSO和乙二醇EG为主要成分的(HM+7.5%DMSO+7.5%EG)、HM+17%DMSO+17%EG+0.4 mol/L Su)冷冻保护液对猪GV期卵母细胞的损伤最小;玻璃化冷冻后卵母细胞透明带、细胞膜损伤,微绒毛消失,线粒体肿胀、基质不均、嵴不明显,胞质内溶解为絮状,有大量空泡;冷冻保护液处理组(未进行玻璃化冷冻)卵母细胞DNA损伤与对照组差异不显著,玻璃化冷冻组卵母细胞DNA损伤与冷冻保护液处理组和对照组均差异显著。结果表明,以DMSO和EG为主要成分的冷冻保护液适合用于对猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻,同时也证实了DNA的损伤主要是由玻璃化冷冻过程的机械损伤所致。     

抗冷冻蛋白Ⅲ对玻璃化冷冻猪GV期卵母细胞及其DNA的保护作用

为了寻找冷冻液中最适合的抗冷冻蛋白Ⅲ（AFPⅢ）添加浓度,并探索AFPⅢ对玻璃化冷冻卵母细胞、活性氧（ROS）及其DNA损伤的保护作用进行评价。本研究分别在冷冻液中添加250、500、750、1 000、1 200 ng/m L AFPⅢ,通过冷冻液处理和冷冻-复苏筛选出最合适的AFPⅢ添加浓度,荧光探针检测卵母细胞中活性氧的含量,彗星电泳检测卵母细胞DNA的变化。结果显示,冷冻液中添加500 ng/m L AFPⅢ对玻璃化冷冻猪GV期卵母细胞的保护效果最佳;冷冻液中添加AFPⅢ的冷冻组ROS含量显著低于冷冻对照组（P<0.05）;添加AFPⅢ的冷冻组尾部DNA百分比（Tail DNA%）和Olive尾矩值（OTM）显著低于冷冻对照组（P<0.05）。结果表明,AFPⅢ可以提高玻璃化冷冻后卵母细胞的体外发育能力,降低冷冻-复苏后卵母细胞ROS含量,缓解玻璃化冷冻引起的卵母细胞DNA损伤。     

黄芪多糖对冷冻前后猪精液中过氧化氢酶活性及其mRNA表达的影响

为了研究黄芪多糖对猪精液冷冻前后过氧化氢酶(CAT)活性及其mRNA表达的影响,用含不同质量浓度(0、0.2、0.4、0.6g/L)黄芪多糖的稀释液稀释美系长白公猪精液,用0.5mL细管分装冷冻,分别检测平衡后及冻融后精液中CAT活性和mRNA表达量的变化。结果显示,0.4g/L黄芪多糖能显著提高冷冻保存的猪精液中CAT活性及平衡后CAT mRNA表达(P0.05),同时冻融后CAT mRNA表达在冷冻组中最高(P0.05)。结果表明,冷冻前后猪精液中CAT活性及平衡后CAT mRNA表达的显著提高是黄芪多糖改善猪精液冻后质量的主要原因之一。     

咖啡因对体外保存精子品质和受精力的影响

在概述咖啡因的来源、结构、饮用价值的基础上,简述了关于咖啡因对稀释的非冷冻保存精液和冷冻保存精液中精子活率和受精力影响的研究状况,认为无论在体外非冷冻保存的精液中还是在冷冻保存的精液中添加适量的咖啡因,均有助于提高精子活率、精子体外保存时间、情期受胎率和体外受精力。最后指出,研究人员应继续优化筛选咖啡因在制作冻精时的适宜添加剂量和添加时机。     

猪流感病毒广东株的分离鉴定及其特性

对广东省 2 5个猪场有呼吸道症状的 30～ 6 0日龄仔猪 ,用棉拭子采样 ,接种鸡胚分离病毒。经鉴定 ,7株为H1N1亚型毒株。对其中 3株分离株的形态学、部分理化特性和生物学特性的研究结果表明 ,病毒粒子在透射电镜下为杆状、丝状、椭圆形及圆形 ,大小为 80～ 12 0nm ;血凝素(HA)均为热不稳定型 ;均不耐热且对乙醚、氯仿敏感 ;均能凝集公鸡、豚鼠、兔、大白鼠、山羊等动物红细胞 ,对小白鼠红细胞的凝集性有所不同 ,均不凝集牛和猪红细胞 ;经绒毛尿囊腔接种 9日龄鸡胚 ,不能导致鸡胚死亡 ,EID50 分别为 10 — 6 .17/ 0 .2mL、10 - 5.83/ 0 .2mL、10 - 4.4 3/ 0 .2mL ;经鼻腔途径感染小白鼠 ,均未导致小鼠出现症状和死亡 ,接种后第 14d在部分存活的小鼠血清中可检出病毒抗体。     

催情快散对雌性小白鼠的催情试验

将 32只性成熟的雌性小白鼠分为 3组 ,试验Ⅰ组饲喂含 5 0 g/kg催情快散的饲料 ,试验Ⅱ组饲喂含 10 0 g/kg催情快散的饲料 ,对照组饲喂不添加催情快散的普通小白鼠饲料。试验第 7d ,试验Ⅱ组有 10只小白鼠发情 ,试验Ⅰ组有 8只小白鼠发情 ,而对照组仅有 2只小白鼠发情 ;第13d解剖全部小白鼠。结果 ,试验Ⅱ组有 9例小白鼠子宫角、子宫体增粗 ,试验Ⅰ组有 7例 ,而对照组仅有 1例。取出子宫卵巢称重 ,试验Ⅱ组和试验Ⅰ组与对照组相比差异极显著 (P <0 .0 1)。试验证明催情快散对雌性小鼠具有催情作用。     

白花杜鹃水提液对多房棘球蚴的体外杀灭和体内感染疗效的研究

为研究白花杜鹃水提液对多房棘球蚴——原头蚴的体外杀灭作用,以及对多房棘球蚴感染小鼠的治疗作用,通过在体外原头蚴培养体系中分别添加白花杜鹃水提液生药质量浓度分别为10、20和40 mg/mL,以阿苯达唑伊维菌素培养基(阿苯达唑的质量浓度为20 mg/mL、伊维菌素的质量浓度为0.83 mg/mL)、阿苯达唑伊维菌素溶剂培养基和常规培养基分别作为对照组进行原头蚴的培养,分别经第0、12小时和第1、2、3、4、5、6、7天观察记录各药物对原头蚴的杀灭效果,并于第7天通过台盼蓝染色比较各组死亡率;将50只感染多房棘球蚴1个月的雌性BALB/c小鼠随机分为5组,每组10只,依次为白花杜鹃水提液低剂量(10 mg/mL,RL组)、中剂量(20 mg/mL,RM组)、高剂量(40 mg/mL,RH组)治疗组,阿苯达唑伊维菌素治疗组(C组),感染不治疗组(IT组),另包括10只健康小鼠作为空白对照组(B组),各组小鼠连续灌胃给药后第7天,第30天后剖检,对小鼠脏器及棘球蚴组织固定并做石蜡切片进行病理学观察。结果显示,白花杜鹃水提液低、中、高剂量组,阿苯达唑伊维菌素溶液组,溶剂对照组以及空白对照组原头蚴培养后第7天后,原头蚴的死亡率分别为54.00%、56.53%、89.27%、57.60%、19.27%和15.80%,白花杜鹃高剂量组与对照组相比差异极显著(P0.01)。多房棘球蚴感染小鼠腹部明显肿胀,剖检可见腹腔内有大量大小不等的包囊。石蜡切片结果表明,RH组小鼠脏器病变程度最低,且RH组和C组小鼠体内少量包囊发生钙化。研究表明,白花杜鹃水提液对体外原头蚴具有杀灭作用,且40 mg/mL白花杜鹃水提液对小鼠感染多房棘球蚴有一定的治疗作用。     

小鼠孤雌胚2-细胞阻滞的研究

为探讨小鼠孤雌胚2-细胞阻滞的机制,本试验以昆明小鼠为研究对象,通过输卵管上皮细胞和垂体细胞作为饲养层培养小鼠孤雌胚胎,分析其作用机理。小鼠卵母细胞通过70mL/L乙醇激活5min,再用2mmol/L 6-DMAP、5μg/mL CB激活3h后,分别在不同饲养层的KSOM培养液中进行培养,观察并比较各培养条件下孤雌胚胎的发育情况。结果,培养至第24小时,各组无显著差异(P>0.05),都有较高卵裂率。培养至第48小时,用两种饲养层细胞培养的孤雌胚胎4-细胞～8-细胞发育效果好,与用单独一种饲养层细胞培养相比,差异显著(P<0.05),与对照组相比,差异极显著(P<0.01);发育至桑囊胚的比例为49.4%(42/85)(P<0.01)。结果表明,含有输卵管上皮细胞和垂体细胞的KSOM培养液可有效促进小鼠孤雌胚胎的发育并通过2-细胞阻滞(通过2-细胞阻滞率为74.1%),并可进一步提高其发育率(桑囊胚率为49.4%)。     

卵丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟及其后续发育的影响

观察了卵丘细胞共培养对小鼠生发泡期部分裸露(PNO)和裸卵(NO)成熟和发育能力的影响;分别用小鼠、大鼠、猪的卵丘细胞与小鼠PNO和NO进行了共培养。检测了小鼠PNO和NO的减数分裂能力、生发泡构型、受精和胚胎发育能力。结果,PNO、NO的减数分裂能力显著(P<0.05)低于卵丘完整复合体(COCs)的减数分裂能力。COCs中SN型卵母细胞比率显著高于PNO和NO中SN型卵母细胞比率(P<0.05),大部分PNO和NO的卵母细胞核型为NSN型。与对照组相比,与小鼠或大鼠卵丘细胞共培养的小鼠PNO和NO的减数分裂能力没有显著提高,但是与猪卵丘细胞共培养却可以提高小鼠PNO和NO的减数分裂能力。结果表明,猪卵丘细胞能促进小鼠卵母细胞的体外成熟,但并不影响小鼠卵母细胞的受精和胚胎发育。     

非解乳糖链球菌FGM对大肠杆菌感染肉鸡肠道健康的影响

本试验旨在研究非解乳糖链球菌FGM对大肠杆菌感染肉鸡肠道健康的影响。选用150只1日龄白羽肉鸡,随机分为3组,每组50只,试验期21 d,饲喂基础日粮。1~10日龄时,空白对照组(BG)和模型组(EG)每只鸡每日灌服0.2 mL的生理盐水,非解乳糖链球菌(FGM)组每只鸡每日灌服0.2 mL浓度为1×10^9 CFU/mL的FGM菌液。FGM组和EG组鸡于14日龄时,灌服1次0.2 mL浓度为6×10^8 CFU/mL大肠杆菌O78菌液。分别于攻毒后第0、1、3和7天,观察各试验组鸡十二指肠肠绒毛结构,检测十二指肠sIgA含量、MPO、GSH-PX和SOD活力及T-AOC含量。结果显示,FGM组鸡十二指肠肠绒毛较EG组完整,MPO活力显著低于EG组(P<0.05),sIgA含量显著高于EG组(P<0.05),GSH-PX和SOD活力与T-AOC含量高于EG组。结果提示,分离于鸡盲肠的非解乳糖链球菌可通过保护肠绒毛结构、调节肠道免疫力与抗氧化能力,增强鸡抗感染力,发挥保护肠道健康的效果。     

印楝油对兔疥螨幼虫的体外杀螨活性

将兔疥螨幼虫置于聚苯乙烯小平皿中,分别加入不同浓度的印楝油液体石蜡溶液,以天然除虫菊酯和阿维菌素为阳性对照,蒸馏水和液体石蜡为阴性对照,观察记录不同时间段的螨虫死亡数,以死亡率、半数致死时间(LT50)和半数致死浓度(LC50)为指标评价了印楝油对兔疥螨幼虫的离体杀螨活性。结果显示,未稀释的印楝油能在25 min内杀死所有幼螨,其杀螨活性显著强于500 g/L的天然除虫菊酯(825 min,P<0.01),而与25 g/L的阿维菌素无显著差异(19 min,P>0.05);500、250和125 mL/L印楝油对兔疥螨幼虫的LT50分别为1、2、5 h;24 h的LC50和LC95分别为2.908和12.018 mL/L。结果证实,印楝油对兔疥螨幼虫具有较好的离体杀螨活性。     

猪胚胎多能性干细胞的分离培养

收集妊娠 2 6 .0～ 2 9.0d的猪胚胎 ,分离培养原始生殖细胞 (PGCs) ,在STO细胞饲养层上生长 ,形成了多能性干细胞 (EG)。发现其具有干细胞的显著特性 ,并能在体外定向分化为神经细胞、上皮细胞和胚泡细胞。试验使用A、B、C 3种不同的培养基培养PGCs ,结果在形成EG细胞集落的数量和EG细胞分化上有着明显的差距 ,说明血清的质量和浓度以及细胞因子对干细胞的生成和增殖有着重要的影响     

绵羊去透明带卵母细胞的孤雌激活

为探索一种简化的绵羊核移植操作程序,比较了不同浓度离子霉素、两种不同激活方法对保留和去除透明带的绵羊卵母细胞孤雌发育的影响。结果,2.5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP激活去除透明带卵母细胞时,卵裂率为78.9%,囊胚发育率为13.7%;采用5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP方法激活保留透明带的卵母细胞时,卵裂率为88.5%,囊胚发育率为14.7%。在WOWs培养中,对去除和保留透明带的卵母细胞,用5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP激活时,卵裂率分别为70.4%和69.2%,用70mL/L无水乙醇+2mmol/L 6-DMAP激活时,卵裂率分别为33.3%和23.0%,离子霉素处理组的卵裂率显著高于无水乙醇处理组。结果表明,透明带的去除与否对卵裂率没有产生影响,但各处理组的卵裂卵均未发育为囊胚。     

鸭疫里氏杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测鸭疫里氏杆菌,以纯化的兔抗1型鸭疫里氏杆菌抗体作为捕获抗体,以纯化的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。最佳的方案为用184ng/孔纯化的多抗包被过夜,100mL/L小牛血清37℃封闭2h,检测抗原、单抗、酶标抗体均为37℃作用1h,显色20min后终止反应,D450nm值高于0.330且P/N>2.1判定为阳性。该方法特异性强,与禽源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌无交叉反应,最低检测剂量为104 CFU/mL。与传统细菌分离方法相比,该方法的敏感性为100%,符合率为85.2%。本研究首次建立了检测鸭疫里氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法,且特异、敏感。     

猪SIgA直接ELISA检测方法的建立及应用

采集猪肠黏液并分离纯化出猪分泌型免疫球蛋白A(SIgA),制备兔抗猪SIgA IgG抗体,经HRP标记,并优化直接ELISA检测猪SIgA的条件,建立了检测猪SIgA的直接ELISA方法。结果显示,筛选的最佳反应条件:黏液蛋白包被浓度为10μg/mL,兔抗猪SIgA IgG-HRP酶标抗体的工作浓度为1∶200,反应时间为60min。包被SIgA浓度标准曲线的线性范围为90～1 400ng/mL,回收率为85.85%～133.88%,变异系数为13.12%～17.67%。采用该方法对猪肺炎支原体灭活疫苗免疫与攻毒后的仔猪肺冲洗液和肠黏液中的SIgA进行检测;结果显示,攻毒后免疫猪肺冲洗液中SIgA含量平均为205.81ng/mL,显著高于攻毒对照猪的147.56ng/mL和空白对照猪的124.37ng/mL(P<0.05);免疫猪肠黏液中SIgA含量平均为67.94ng/mL,与对照猪无明显差异。结果证实,建立的猪SIgA直接ELISA方法具有经济、适用和准确的特点。     

紫外线照射对牛孤雌激活卵母细胞和体细胞核移植胚胎体外发育的影响

分析了紫外线 (ultraviolet,UV)照射对牛孤雌激活卵母细胞和体细胞核移植胚胎卵裂和体外发育的影响。结果发现 ,经UV照射 2 0s和 40s的卵母细胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚发育率都极显著低于UV照射 0s和 1 0s的卵母细胞 (P <0 .0 1 ) ,表明UV照射卵母细胞超过 2 0s降低了孤雌激活胚胎的卵裂和体外发育潜力。核移植中UV照射卵母细胞 2 0s后 ,重组胚的卵裂率极显著低于卵母细胞照射 0s和 1 0s时所构建的重组胚 (P <0 .0 1 ) ,但囊胚发育率无显著差异 (P>0 .0 5 ) ;而UV照射卵母细胞 40s时 ,所构建的重组胚的卵裂率和囊胚发育率都明显低于其他各组 ,表明超过 2 0s的UV照射显著降低了重组胚的卵裂和体外发育潜力。研究结果表明 ,核移植中用UV指导卵母细胞去核时UV照射时间应控制在 2 0s以内 ,UV照射 1 0s对核移植胚胎的发育不产生任何负面影响