猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立及初步应用

自2014年美国首次报道猪Delta冠状病毒(PDCoV)以来,该病毒相继在我国一些猪场检测到,由于其发病症状和病理剖检与猪流行性腹泻(PED)极其相似,且易出现混合感染,临床很难区分,给养殖业造成严重经济损失,因此建立能够同时检测且能区分这两种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PDCoV和猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因序列,设计了2对分别用于扩增PDCoV N基因和PEDV M基因的目的片段的引物,通过对RT-PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PDCoV和PEDV的双重RT-PCR检测方法,并对该方法进行了灵敏性、特异性和重复性研究。结果显示,该双重RT-PCR对PD-CoV和PEDV的最低检测量分别是3.14×10~3 copies/μL和3.88×10~4 copies/μL。该方法仅对PDCoV和PEDV检测为阳性,对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、博卡病毒(PBoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病毒(PRV)等猪常见的感染病毒的扩增均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。用建立的双重RT-PCR方法对111份临床样品进行检测,其中PDCoV阳性样品22份,阳性率为19.82%,PEDV阳性样品27份,阳性率为24.32%,PDCoV和PEDV共感染的样品数为10份,阳性率为9.01%。本试验所建立的双重RT-PCR方法能够快速、准确地对PDCoV和PEDV单一或混合感染的临床样品进行快速检测,为临床上对PDCoV和PEDV鉴别诊断和流行病学调查研究提供了新的技术手段。     

猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)基因序列,分别设计特异性引物,扩增PEDV N基因(750 bp)、TGEV M基因(544 bp)、PDCoV N基因(183 bp)和PRoV VP6基因(329 bp)。经过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化及特异性、敏感性、重复性试验,成功建立了快速鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法仅对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV检测为阳性,对口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)等主要病毒的扩增均为阴性。PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV重组质粒标准品的检出下限分别为1.57×10~2、1.57×10~3、1.57×10~2、1.57×10~2copies/L。相同条件下的重复性试验获得均匀一致的结果。应用所建立的方法检测2017—2018年采集自广西各地的270份腹泻病料,结果显示,PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为15.56%、11.48%、10.74%、1.85%,并且存在混合感染现象。上述结果表明,所建立的多重RT-PCR方法可用于PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的快速鉴别检测及流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别检测方法,针对PEDV基因序列设计3对特异性引物。第1对引物扩增野毒株(经典株、变异株)和疫苗株ORF3基因198 bp和148 bp片段;第2对引物扩增经典株和疫苗株S基因429 bp片段;第3对引物扩增变异株S基因274 bp片段。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PEDV经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异地检测PEDV,而与猪的其他重要病原FMDV、CSFV、PRRSV、TGEV、PRo V、PCV2、PRV无交叉反应;对重组质粒标准品的检出下限为2.62×10~2copies/L;重复试验获得了均匀一致的结果。应用该方法检测336份临床病料,PEDV阳性的120份,其中变异株96份、疫苗株21份、变异株和疫苗株混合感染3份。结果表明,本研究所建立的多重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于PEDV经典株、变异株和疫苗株的快速鉴别检测和流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株与经典毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的快速RT-PCR检测方法,根据GenBank中PEDV S基因序列设计合成1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV变异毒株的RT-PCR方法。结果显示,建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分疫苗株CV777和PEDV变异毒株,仅能扩增出PEDV变异毒株826bp的目的片段,与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法能检测到的最低核酸质量为11.3pg。利用该方法对采集自广西部分地区的123份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV阳性率为67.5%,变异毒株占总PEDV毒株的86.7%(72/83)。结果表明,该RT-PCR鉴别诊断方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为开发一种快速、准确、灵敏及定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对PEDV S基因的特异性引物,建立以SYBR GreenⅠ为染料的荧光定量RT-PCR检测方法,对疑似PEDV感染的临床样品进行检测并与普通RT-PCR结果进行比较。结果显示,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R~2=1,其扩增效率E=2.03,熔解曲线为尖锐单峰;不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,具有较强的特异性;最低检出浓度(1×10~1copies/μL)比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性和稳定性好;将36份临床样品检测结果进行比较,与普通RT-PCR的总符合率为88.89%。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏度高,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。     

PEDV-TGEV-RV三重PCR检测方法的建立

根据G en Bank中已登陆的猪流行性腹泻病毒(PED V)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PEDV的N基因、TGEV的M基因、RV的VP7基因的目的片段;通过优化反应体系,建立了同时检测PEDV、TGEV、RV的三重PCR检测方法。敏感性和特异性试验的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为39.5 pg(PEDV)、38.1 pg(TGEV)和51.6 pg(RV)。该方法可同时扩增477 bp(PEDV)、263 bp(TGEV)、355 bp(RV)的特异性基因片段,而对猪瘟病毒(CSF V)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)等病毒的检测结果均为阴性。三重PCR与单一PCR的符合率为100%。上述结果表明,该方法的建立对于这3种病毒的临床快速检测与流行病学调查具有十分重要的意义。     

PEDV-TGEV-RV多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

本试验旨在建立同步共检猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)的多重RT-PCR检测方法。参照PEDV的M基因(JQ023161)、TGEV的N基因(JX013850),RV的VP7基因(AY707788),利用Primer Premier 5.0软件设计筛选能特异性扩增PEDV、TGEV、RV相应基因的引物。并对引物浓度、退火温度等扩增条件进行优化,建立了一种能同时共检PEDV、TGEV和RV的多重RT-PCR方法。该方法对PEDV、TGEV和RV均能分别扩增出大小为347、779和510bp的预期片段;该方法灵敏度高,最低可以检测约1.5×105拷贝的阳性RNA模板;该检测方法特异性强,TGEV、PEDV、RV三种病毒核酸检测体系内无交叉反应,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本脑炎病毒和伪狂犬病病毒的RNA或DNA检测均为阴性。应用该方法检测135份临床样品,TGEV、PEDV和RV的阳性检出率分别为2.96%、82.2%和2.22%,与常规单一RT-PCR的检测结果进行比较分析,符合率均为100%。上述研究结果表明该方法是一种简便、快速、同步共检PEDV、TGEV和RV的有效方法。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为开发一种快速、准确、灵敏及定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对PEDV S基因的特异性引物,建立以SYBR Green I为染料的荧光定量RT-PCR检测方法,并对疑似PEDV感染的临床样品进行检测并与普通RT-PCR结果进行比较。结果显示,所建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R~(2)=1,其扩增效率E=2.03,熔解曲线为尖锐单峰;不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪δ冠状病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,具有较强的特异性;最低检出浓度（1×10~(1) copies/μL）比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性和稳定性好;将36份临床样品检测结果进行比较,与普通RT-PCR的总符合率为88.89%。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏度高,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。     

兔出血症病毒与欧洲野兔综合征病毒复合RT-PCR检测方法的建立

为建立用于兔出血症病毒(RHDV)和欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)诊断鉴别的快速检测方法,根据GenBank中的RHDV和EBHSV基因组序列,设计合成5条特异性引物和9条重叠延伸引物,分别以通过重叠延伸PCR人工合成的EBHSV VP60基因中359bp基因片段构建的重组质粒pGM-T-EBHSV和RHDV RT-PCR产物构建的pGM-T-RHDV为模板,经过反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,初步建立了RHDV和EBHSV的复合RT-PCR检测方法,并对20份临床样品和5份RHDV人工感染样品进行了检测。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和EBHSV的特异性目的片段192bp和335bp,对2种病毒的检测限度均可达到50copies的目的基因片段,兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌和沙门氏菌核酸扩增均为阴性。样品检测结果显示,5份人工感染样品的RHDV检出率为100%,20份临床样品的RHDV检测为阴性。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光LAMP检测方法的建立

本研究为建立一种检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的二重荧光(LAMP)技术,根据已发表的CSFV E2基因和PRRSV NSP2基因序列保守区域,分别设计并合成了2组针对CSFV和PRRSV序列的特异性引物和2条探针,在CSFV探针5′端标记FAM荧光基团,3′端标记BHQ1淬灭基团,PRRSV探针5′端标记CY5.5荧光基团,3′端标记BHQ2淬灭基团。用设计的引物、探针及反应试剂组成反应体系,建立CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法。对建立的方法进行特异性、敏感性、干扰性试验,并用临床样品进行验证。结果显示,本研究成功建立了鉴别CSFV和PRRSV的二重荧光LAMP方法,该方法只检测出CSFV(绿色)或PRRSV(红色)或CSFV和PRRSV混感(黄色),而对照毒株则无荧光颜色出现,具有较好的特异性。敏感性检测CSFV或PRRSV的含量浓度,其最低检测浓度均为100 copies/mL,敏感性较好。干扰性结果显示,高低不同的模板浓度不影响本方法的检测扩增,干扰性小。对112份采集的临床样品进行检测,结果,检出CSFV阳性样品41份,PRRSV阳性样品12份,CSFV和PRRSV同时为阳性的样品3份,该结果与荧光定量RT-PCR方法的检测结果一致。上述结果表明,本研究建立的CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性,并具有检测临床样品中CSFV和PRRSV的潜力。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-LAMP检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守序列各设计一套LAMP引物,在同一体系中进行RT-LAMP扩增,通过对体系内引物浓度及反应温度等进行优化,建立了可在63℃恒温下对CSFV和PRRSV进行同步检测的LAMP方法,并进行了敏感性和特异性试验。结果显示,该方法的灵敏度与荧光定量RT-PCR相当,与常规RT-PCR相比高10倍;用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行RT-LAMP扩增,均未发生交叉反应。用该法对采自天津市4个猪场的52份临床样品进行检测,与荧光定量RT-PCR检测结果的符合率为100%。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,可实现两病原的同步快速检测,是临床疫病初筛技术的强有力候选。     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立与应用

本研究为建立一种针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速检测方法,根据PRRSV O RF7基因保守区域序列,设计了三对特异性引物。通过Bst D N A聚合酶、引物、Mg2+、d NT Ps和SY BR G reenⅠ及H NB染料浓度等反应条件优化,建立了PRRSV反转录-环介导等温核酸扩增(RT-L AMP)检测方法 ,62℃条件下反应35 min,肉眼可见白色沉淀,1.5%琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带,SYBR GreenⅠ染料显示呈绿色。该方法的最低检测限(TCID50)为1×100.5/m L,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪流行性腹泻病毒等病原均无交叉反应。110份临床样品检测结果显示,PRRSV阳性率60.0%,与RT-PCR检测结果符合率为85.5%。上述结果说明,该方法操作简便,灵敏特异,可用于PRRSV临床样品的快速诊断。     

猪生殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法的建立

针对美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了一套RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为10个拷贝,而RT-PCR的最低检出限为1×104个拷贝.分别用建立的RT-LAMP法与RT-PCR法对临床50份样品进行检测,结果二者的符合率在96%以上,呈现很好的一致性.表明,建立的RT-LAMP法可应用于PRRSV的快速检测.     

猪非典型瘟病毒和盖塔病毒双重RT-PCR方法的建立与应用

为快速准确地检测出猪非典型瘟病毒(APPV)与盖塔病毒(GETV),根据GenBank中公布的APPV NS3基因和GETV NSP3基因序列,选择APPV NS3基因和GETV NSP3基因的保守序列,各设计并合成了1对特异性引物。通过优化反应体系和反应条件,最终建立可以同时扩增出500和810 bp特异性片段的双重RT-PCR。该方法对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪流行性腹泻病毒的扩增结果均为阴性。对APPV和GETV重组质粒的最低检出量分别为187和126 copies/μL并具有高重复性。应用本方法检测从四川自贡市、泸州市等地采集的38份仔猪肌肉震颤样本,结果显示,APPV、GETV的阳性率分别为13.16%和7.89%,与单一RT-PCR方法对APPV和GETV的检出率完全一致。本研究中成功建立的APPV、GETV双重RT-PCR方法为APPV和GETV的快速检测提供了技术手段,有助于仔猪先天性震颤的临床诊断和流行病学调查,对于公共卫生也有一定意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典毒株的序列差异,分别设计了1对特异性鉴别引物和1条TaqMan探针,建立了检测PRRSV变异株的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,建立的方法可鉴别诊断PRRSV变异株和经典毒株,具有较高的特异性;可以检测相当于1TCID50的病毒模板,比常规RT-PCR方法的灵敏度高100倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<10%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对13份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出11份阳性,高于常规RT-PCR方法。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法能检测高致病性PRRSV变异株,不仅特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于变异PRRSV的临床诊断和流行病学调查。     

小反刍兽疫病毒RT-PCR检测方法的建立

通过分析小反刍兽疫病毒(PPRV)不同毒株的N基因序列,根据N基因保守区序列设计了1对引物,根据肌动蛋白基因序列设计了另1对引物作为内参,建立了小反刍兽疫RT-PCR诊断方法,预期扩增片段分别为687bp和493bp。以PPRVNigeria75/1株RNA和山羊组织总RNA混合物为模板,在RT-PCR反应体系内同时加入绵羊肌动蛋白基因引物和PPRVN基因引物,结果可扩增出2条目的条带,序列测定结果证实,分别扩增出了目的基因。对RT-PCR反应条件进行了优化,在最佳反应条件下,该RT-PCR最低可检测到12TCID50/mL的病毒RNA。用该方法对人工感染PPRVNigeria75/1株山羊的血液样品进行检测,结果可扩增出目的基因片段。表明建立的RT-PCR方法具有较好的特异性、敏感性和准确性。     

猪瘟病毒NASBA-ELISA检测方法的建立与应用

为建立猪瘟病毒NASBA-ELISA检测方法,以猪瘟病毒(CSFV)E2基因为研究对象,利用Prim-er 5.0和Blastn生物软件,设计并合成了特异的核酸序列依赖扩增(NASBA)引物和探针。经条件优化,确定的最佳扩增反应条件为42℃,反应1.5h。临床检测结果显示,用该方法可特异地扩增CSFV E2基因约155bp的目的片段,而对TGEV、PRRSV、PCV2、PPV、PEDV、APP和PK-15正常细胞等核酸的检测均为阴性,可最低检出1×100～1×101 copies/μL,其灵敏度比RT-PCR略高。应用该方法对采自重庆部分地区猪场的125份样品进行了检测;结果,猪瘟病毒阳性检出率为5.6%,NASBA-ELISA法与RT-PCR法的检出符合率为94.4%。结果表明,NASBA-ELISA方法可应用于CSFV的快速鉴别检测。     

水泡性口炎病毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)的快速鉴别检测方法,本研究根据水泡性口炎病毒2种血清型相对保守的L基因为靶序列,分别设计2对型特异性引物和2条不同荧光基团修饰的探针。经过对反应体系的优化,建立了能够同时检测VSV-IND和VSV-NJ的双重荧光RTPCR方法。该方法能准确鉴别VSV两种血清型,与口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无非特异性扩增,特异性强。与普通RT-PCR相比,反应快速、灵敏度高。Ct值的变异系数小于3%,重复性好。利用所建立方法对126份临床样品进行检测,结果与普通RT-PCR相同。上述结果表明,本研究建立的方法为VSV-IND和VSV-NJ的同时鉴别检测提供了一种快速、特异和敏感的方法。     

猪传染性胃肠炎病毒半巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种高效、敏感、特异的用于检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的半巢式RT-PCR方法,本研究依据GenBank发表TGEV的N基因序列设计3条特异性引物,通过优化反应体系,建立了检测TGEV的半巢式RT-PCR方法,并对反应体系特异性和敏感性进行了检测。结果显示,该方法能够成功扩增483 bp和338 bp两条目的条带;对TGEV具有良好的特异性,与猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪德尔塔冠状病毒均无交叉反应;最低可检测到1.86×10~(-1)pg/μL的TGEV cDNA。用所建半巢式RT-PCR对临床50份猪腹泻样品进行检测,结果显示,阳性率为36%,高于普通RT-PCR阳性检出率,且阳性样品符合率为100%。本试验所建立的半巢式RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性好,可准确地对TGEV感染做出诊断,为TGEV的临床检测、流行病学调查提供了有效手段。