表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌的构建及其免疫原性的研究

为探究表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌口服免疫动物诱导的特异性免疫应答,本研究构建了p MG36e-SLN重组质粒并将其电转化至乳酸乳球菌感受态细胞MG1363中,制备表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌,经SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定目的基因表达,并将重组菌口服免疫新西兰大白兔,利用间接ELISA方法测定家兔小肠黏膜和血清中抗SLN蛋白特异性Ig G和Ig A。结果显示,表达重组SLN蛋白的重组菌经口服能够有效引起动物体产生较高水平抗SLN蛋白Ig G和一定量的抗SLN蛋白Ig A,表明该重组菌表达系统能刺激动物免疫系统产生应答,具有作为口服疫苗的潜在应用价值。     

表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答

为研究猪流行性腹泻病毒中和抗原位点(COE)基因在乳酸菌中的表达情况,进而探讨重组乳酸菌的免疫原性。将COE基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG-1中,构建重组表达载体pPG-1-COE,并将其电转化入干酪乳杆菌Lactobacilluscasei393中,应用Western-blotting、间接免疫荧光染色和全细胞ELISA检测重组蛋白的表达情况,用重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠,测定免疫应答水平。结果表明,COE可在构建的重组干酪乳杆菌表达系统中表达,目的蛋白定位于细胞表面。在免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA(P0.01);血清具有中和活性(1∶12);脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组,IL-4和IFN-γ水平显著提高(P0.01)。证实,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生对猪流行性腹泻病毒特异的黏膜免疫应答和系统免疫应答。     

基于猪流行性腹泻病毒S1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)HuN株S1蛋白的基因序列(GenBank:JQ517274)构建哺乳动物细胞重组表达质粒pIRES-S1。利用电转法将pIRES-S1转染至ST细胞,经过G418加压筛选、Western-blot检测、悬浮驯化后,得到能表达S1蛋白的ST稳转细胞池。Western-blot结果显示,S1蛋白具有良好的反应原性。以S1蛋白作为包被抗原初步建立间接ELISA方法,并对PEDV临床血清和进口种猪PEDV阴性血清进行检测,以血清中和试验为标准,结果显示,该ELISA方法敏感性为96.3%,特异性为97.7%,与血清中和试验具有很高的一致性(kappa值=0.882,P0.05)。应用ELISA方法对PEDV返饲猪跟踪血清检测,结果显示,该方法能准确地评估感染猪体内PEDV IgG抗体水平消长规律。上述结果表明,本研究建立的基于S1蛋白的ELISA方法具有高敏感性和高特异性,可用于临床猪血清中PEDV抗体的检测,为猪群PEDV的免疫评估提供有效依据。     

猪流行性腹泻病毒S2蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用

本研究基于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S2截短蛋白,建立了特异性IgG抗体的间接ELISA检测方法,用于临床PEDV特异性抗体水平的监测.前期筛选了富含中和表位的S2截短基因,体外表达后作为ELISA包被抗原,用于捕获PEDV IgG抗体,以山羊抗猪HR...     

猪流行性腹泻病毒重组S1蛋白的免疫原性评价

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株S1基因经密码子优化后克隆到慢病毒表达载体,在293T细胞包装PEDV S1重组慢病毒;重组慢病毒感染293T细胞,经有限稀释法筛选获得高效稳定表达S1蛋白的重组细胞系HEK-293T-S1;生产、纯化S1蛋白,添加佐剂制备成重组S1亚单位疫苗,经肌肉注射免疫实验用巴马小型猪,评价...     

表达副鸡禽杆菌外膜蛋白的重组乳酸乳球菌的构建及其免疫原性研究

为构建表达副鸡禽杆菌外膜蛋白的重组乳酸乳球菌,本试验按照乳酸乳球菌表达的偏好性,优化合成副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的编码碱基序列,将其接入表达载体pNZ8149的多克隆位点并导入食品级乳酸乳球菌NZ3900。将重组乳酸乳球菌灭活后经肌肉注射免疫SPF鸡,免疫后攻毒测定乳酸乳球菌的保护效果,检测血清中Ig G抗体和鼻黏膜sIgA抗体水平并检验免疫效果。PCR结果显示,成功构建了含p9片段的重组乳酸乳球菌,Western-blot检测显示,p9片段可在重组乳酸乳球菌内表达。重组菌最佳诱导表达条件:Nisin浓度为20 ng/m L、诱导时间为4 h。鸡肌肉注射免疫后可产生p9蛋白特异性的血清Ig G和鼻黏膜sIgA抗体。乳酸乳球菌重组疫苗免疫鸡对副鸡禽杆菌攻毒的保护率为60%~80%。结果表明,本研究成功构建了重组乳酸乳球菌pNZ8149-p9/NZ3900,该重组菌作为免疫原免疫鸡,对副鸡禽杆菌攻毒具有较好的免疫保护作用。     

基于乙肝核心抗原和猪流行性腹泻病毒S蛋白B细胞复合表位基因重组疫苗的免疫原性研究

为了研制新型、有效的猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗,本研究以乙肝核心抗原蛋白(HBcAg)作为多表位免疫原的载体蛋白,将PEDV S蛋白中的3个B细胞表位基因与S1截短序列基因串联后,插入到编码HBcAg的免疫显性区的基因中,构建重组质粒HBcAg-PE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白HBPE经过纯化和Western-blot鉴定后,以不同剂量的重组蛋白通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,对其免疫效果进行了初步评价。结果显示,重组蛋白HBPE在BL21(DE3)中以沉淀形式表达,纯化、复性后的重组蛋白HBPE能够与PEDV阳性血清发生特异性反应。重组蛋白HBPE能够刺激小鼠产生抗PEDV特异性抗体,同时可以产生相关的Th1型和Th2型细胞因子。上述结果表明,本研究成功构建了PEDV重组B细胞复合表位抗原HBPE,并在小鼠模型中初步评价了其免疫原性,为今后新型PEDV基因工程疫苗的研制提供了新的思路。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株的构建及动物免疫试验

为了构建表达猪瘟病毒E2蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株,亚克隆猪瘟病毒E2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建了重组质粒pYA3341-E2。将该重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E2),并对重组菌表达的E2蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析、测定其在体内外的稳定性、生长曲线、安全性及动物免疫试验。结果显示,重组菌能表达E2蛋白且表达的蛋白能与猪瘟病毒阳性血清特异性结合。在体外营养选择压力下,重组菌株在体外可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾。小鼠口服试验证实重组菌无毒性,安全可靠。动物免疫试验表明,口服重组菌免疫猪产生了抗E2蛋白抗体。淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱导机体产生较强的细胞免疫应答。结果表明,成功构建了能稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究猪瘟口服基因工程疫苗奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白富含表位区域的原核表达与鉴定

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪腹泻的重要病原之一,给世界养猪业带来严重危害。本研究对PEDV分离株JS-2纤突蛋白(S)进行抗原表位分析,选择3个富含表位片段的区域。通过RT-PCR扩增基因序列,克隆入p ET32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并进行诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,成功表达了3个重组蛋白,分子质量与预期大小一致。将蛋白进行割胶回收,与油佐剂乳化后免疫小鼠,制备超免疫血清,利用PEDV包被抗原进行ELISA检测,结果免疫小鼠血清D450值达1.0左右,证实筛选制备的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

猪流行性腹泻病毒黏液SIgA抗体ELISA检测方法的建立

旨在建立一种检测黏液中猪流行性腹泻病毒(PEDV)特异性SIgA的ELISA方法,从而评价PEDV黏膜免疫水平。首先将PEDV的S1D基因(534～789 aa)克隆至质粒载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,其表达产物以包涵体形式存在。Western-blot验证蛋白大小为32 ku,且具有抗原活性。再以8 mol/L尿素变性蛋白,经纯化、梯度复性后作为包被抗原蛋白,通过优化条件初步建立检测鼻腔和口腔黏液中PEDV特异性SIg A抗体的间接ELISA,并确定其最佳抗原包被浓度为2μg/m L;鼻腔黏液最佳稀释度为1∶1,最佳封闭液为50 g/L脱脂乳;口腔黏液最佳稀释度为1∶2,最佳封闭液为30 g/L BSA;酶标抗体最佳稀释度均为1∶2 000。最后应用该方法分别检测了84份已免疫猪的口腔、鼻腔黏液,其结果与以纯化的PEDV包被的间接ELISA相比,符合率达到95.2%。本研究中建立的检测黏液中PEDV特异性SIgA的方法简便快速,具有较好的敏感性、特异性,这为评价PEDV黏膜免疫水平提供了依据和检测标准。     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的血清学方法,本研究以原核表达的猪流行性腹泻病毒AH2012株N蛋白为包被抗原,通过条件优化建立了一种快速的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。利用该ELISA检测猪流行性腹泻病毒血清时为阳性,而与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒,猪圆环病毒2型、猪呼吸道冠状病毒的阳性血清均无交叉反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5.55%;该方法与中和试验检测结果总符合率为88.75%。本研究建立的方法可以应用于我国猪流行性腹泻病毒的诊断、流行病监测以及疫苗研发时抗体水平的检测,为该病的防控提供一种有效的检测工具。     

PRRSV GP3蛋白和PCV-2Cap蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的小鼠免疫试验

为了研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病双价基因工程亚单位疫苗,利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白和猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF3-ORF2,并对该重组病毒进行Western-blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验以及淋巴细胞增殖试验。结果显示,重组杆状病毒表达了重组GP3蛋白和Cap蛋白;该重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP3蛋白和Cap蛋白,并且重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠产生了抗PRRSV和抗PCV-2的特异性抗体,免疫小鼠血清中抗PRRSV和抗PCV-2的中和抗体效价分别达到1∶9.6和1∶13.6。淋巴细胞增殖试验表明,该重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答。结果表明,表面展示PRRSV GP3蛋白和PCV-2Cap蛋白的重组杆状病毒已构建成功,这为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和PCV-2的共感染奠定了基础。     

猪萨佩罗病毒VP1蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

为建立猪萨佩罗病毒(PSV)的快速检测方法,本试验以重组VP1蛋白为包被抗原建立了检测PSV Ig G的间接ELISA方法。RT-PCR从PSV分离株SHCM2019中扩增VP1基因,将其克隆到原核表达载体p ET28a,对重组质粒pET28a-VP1进行原核表达,经Western-blotting检测后,利用VP1重组蛋白建立检测猪血清中PSV Ig G抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的VP1蛋白分子质量约为40 ku,与预期大小相符,Western-blotting表明,重组蛋白与PSV抗体阳性血清具有良好反应原性。以VP1蛋白为抗原建立的ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的阳性血清均无交叉反应,特异性好;批内和批间的变异系数均小于10%,重复性好。利用建立的间接ELISA方法对95份猪临床血清样本进行检测,阳性率为44.21%。本研究建立的检测方法为PSV的血清学诊断提供了可靠手段。     

携带猪流行性腹泻病毒S基因的减毒鼠伤寒沙门菌的构建与鉴定

为构建可有效抵抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)入侵的诱导黏膜免疫反应的核酸疫苗,采用RTPCR方法扩增了PEDV SC-L株的S基因主要抗原编码区域(简称S1),插入pMD19-T载体,构建载体pMD19-T-S1,再将S1基因片段插入双启动子真核表达载体pVAXD中,构建了pVAXD-S1表达载体。经免疫荧光法鉴定S1基因可在COS-7细胞中正常表达后,将pVAXD-S1电转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中,构建了携带S1基因的重组减毒沙门菌SL7207(pVAXD-S1),并对该重组菌株的生长曲线、携带质粒的稳定性、口服小鼠的安全性及目的基因在体内转录等特性进行了鉴定。结果显示,SL7207(pVAXD-S1)在含卡那霉素(100μg/mL)的培养环境中稳定性良好,以每只1×109 CFU口服免疫BALB/c小鼠具有良好的安全性,携带的S1基因能在小鼠回肠末端组织内正常转录及表达。本研究为深入开展减毒沙门菌疫苗菌株SL7207(pVAXD-S1)的免疫评价及构建PEDV与其他抗原基因联合免疫DNA疫苗奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用

用猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白单克隆抗体IgG包被酶标板,以纯化的PEDV作为捕获抗原,建立了PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法。优化后该方法的反应条件为:单克隆抗体包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h加4℃过夜;含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液作为封闭液,37℃封闭3h;捕获抗原的质量浓度为5μg/mL,37℃作用3h;被检猪血清做1∶50稀释,37℃作用1h;山羊抗猪IgG-HRP稀释度为1∶2 000,37℃作用45min;底物最佳作用时间为37℃10min。设定阴阳性血清抗体对照,计算血清样品的S/P值,S/P值≥0.37判为阳性,S/P值0.323判为阴性,介于两者之间为可疑。用建立的ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等阳性血清,结果均无交叉反应性。该方法的批间和批内变异系数均小于10%。相对国产商品化抗体检测试剂盒,其敏感性、特异性和符合率分别为94.6%、91.3%和93.3%。应用本方法检测山东、浙江和江苏省的308份猪血清样品,结果 PEDV抗体阳性率达89.29%。结果表明,建立的抗原捕获ELISA敏感性、特异性和重复性良好,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。     

表达传染性腔上囊病病毒VP2蛋白重组乳酸菌的构建及其免疫保护效果

为探讨表达传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2蛋白重组乳酸菌的口服免疫效果,采用RT-PCR方法扩增了1株IBDV流行毒株的VP2基因,再分别亚克隆到干酪乳杆菌和乳酸乳球菌的表达载体pPG2和PNZ8112中,并分别电转化干酪乳杆菌L.casei393和乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞,构建了重组菌pPG2-VP2/L. casei393和PNZ8112-VP2/NZ9000.分别经20 g/L乳糖和1 ng/mL的乳链菌肽诱导表达后,对菌体裂解物进行了SDS-PAGE和Western-blot分析.结果显示,重组菌pPG2-VP2/L.casei393和pNZ8112-VP2/NZ9000的裂解物中分别出现大小约为53 ku和50 ku的反应带,大小均与预期结果相符,表明目的蛋白在重组菌中得到了表达.重组菌pPG2-VP2/L. casei393和pNZ8112-VP2/NZ9000分别口服免疫SPF雏鸡后,均刺激机体产生了特异性抗IBDV VP2蛋白的血清抗体;攻毒保护试验结果显示,其保护指数分别为62.5%和37.5%,表明重组菌免疫雏鸡后,对IBDV的攻击均具有不同程度的免疫保护作用.     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

应用杂交瘤技术获得了1株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞2D6。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,诱生腹水抗体效价达1∶6×104,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以及禽传染性支气管炎病毒(IBV)抗原之间均无交叉反应;ELISA阻断试验表明,TGEV特异性阳性血清对TGEV-McAb有明显的阻断作用,该McAb所识别的抗原是TGEV所特有的抗原决定基。     

基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用

本研究旨在原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epizootic diarrhea virus,PEDV)的核衣壳(N)蛋白,以重组N蛋白作为包被抗原建立PEDV血清抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。克隆PEDV N基因并将其插入到原核表达载体p ET-28a中,转化BL21感受态细胞进行诱导表达,对表达的N蛋白进行镍柱纯化及Western-blot鉴定;将纯化的N蛋白作为包被抗原并优化反应条件,建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达得到大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot检测表明N蛋白具有良好的特异性和反应原性。PEDV间接ELISA方法的最优反应条件为抗原包被量每孔0.05 g,血清以1∶200倍稀释,作用1.0 h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释,作用1 h,TMB显色时间为25 min。在该优化条件下,D4500.269为阳性,反之为阴性。特异性试验表明,对PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;对96份阳性血清进行检测,敏感性为98.9%。重复性试验表明,批内变异系数0.99%~2.33%,批间变异系数3.54%~6.67%。用本试验建立的体系对临床上164份血清进行检测,阳性率为56.7%,与标准试剂盒的符合率为95.1%。总之,本试验建立的基于原核表达的N蛋白作为检测抗原的PEDV血清间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、重复性好,可用于临床PEDV血清抗体的检测。     

猪流行性腹泻病毒CH/S株M蛋白全长的原核表达及其反应原性分析

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/S株M蛋白的基因组序列,设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出M基因,将其克隆至原核表达栽体pMXB10,构建了重组质粒pMXB-M,经测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3),并进行了IPTG诱导表达.结果显示,重组茵pMXB-M表达的融合蛋白MBP-M-CBD(rM)...     

PEDV结构蛋白S和M在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒鉴定

为在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和M蛋白,并探讨S和M蛋白能否自动组装成病毒样颗粒(VLPs)分泌至培养基中,本研究构建了 3种不同的重组质粒(pFastBac-S、pFastBac-M和pFastBac-S-M),转化入DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定获得重组Bacmid,通过转染...