A型塞内卡病毒VP2蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测塞内卡病毒VP2蛋白的间接ELISA方法,本试验将A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘式方法优化反应的最佳血清稀释度和抗原包被量,同时对间接ELISA方法的其他反应条件进行了筛选。结果显示,VP2蛋白包被量为2μg/m L(1∶1000稀释);用2%BSA封闭液稀释标准阳性血清为1∶20;二抗做1∶5000稀释;TMB底物显色液室温避光显色反应10 min。特异性试验结果显示,同FMDV、PRRSV、CSFV、PRV和APP阳性血清均无交叉反应。此方法对塞内卡病毒阳性血清的敏感性为1∶160。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本分别进行间接荧光抗体免疫方法和间接ELISA方法的检测,结果符合率为95.5%。上述结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。     

马立克病肿瘤相关抗原间接ELISA检测方法的建立

用自制并纯化的马立克病肿瘤相关表面抗原(MATSA)免疫SPF级BALB／c小鼠制备阳性对照抗体,以SPF级BALB／c小鼠血清为阴性对照抗体,筛选间接ELISA检测MATSA抗体的最佳反应条件。结果,包被液为0．1 mol／L pH 9．6的碳酸盐缓冲液,抗原包被浓度为4μg／mL,封闭液为含10 g／L BSA的PBST,抗血清稀释比例为1:800,酶标抗体稀释比例为1:1200,酶标抗体作用时间为37℃温育45 min,底物作用时间为37℃温育15 min,终止液为2 mol／L H2SO4,洗涤4次,每次1min为最佳反应条件。将建立的方法应用于MATSA单克隆抗体研制过程中阳性克隆的筛选,成功获得了MATSA的单克隆抗体,表明该优化条件为间接ELISA检测MATSA抗体的最佳反应条件。     

丝状霉形体山羊亚种血清抗体间接ELISA检测方法的建立

利用丝状霉形体山羊亚种标准株PG3制备抗原,经纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于检测丝状霉形体山羊亚种血清抗体。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为1.09μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物的最佳稀释度为1∶40 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h。判定标准为样品D490 nm值与标准阴性血清D490 nm值之比(P/N)≥3为阳性,≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑。重复性和稳定性试验证明,建立的间接ELISA的稳定性和重复性良好,与间接血凝试验相比,其敏感性较高。     

小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种能快速、特异、敏感地检测血清中小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的方法,通过RT-PCR方法扩增出1 830bp的小反刍兽疫病毒的H基因,并将其克隆至原核表达载体pET-22b(+)中,进行H基因的重组表达。采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。通过矩阵法优化抗原最佳包被浓度、血清稀释度、最佳封闭剂、酶标二抗的最佳稀释度及孵育时间。结果显示,重组H蛋白(分子质量为68ku)能与PPRV阳性血清发生特异性反应。用建立的间接ELISA与标准竞争ELISA试剂盒检测92份临床样品并进行比较,两者的符合率为94.11%。结果表明,本研究建立的间接ELISA可以用于临床PPRV抗体的检测。     

Ⅰ群禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

为建立一种检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVⅠ)抗体的间接ELISA方法,以FAVⅠhexon重组蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立了FAVⅠ抗体间接hexon-ELISA检测方法。抗原最佳包被浓度为10.0μg/mL,最适包被条件为37℃2h加4℃过夜;最佳封闭液为50g/L脱脂乳;血清最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为75min;酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 000,最佳作用时间为45min;hexon-ELISA阴性、阳性临界值为0.379。用建立的hexon-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为45%。结果表明,建立的hexon-ELISA方法简便、快捷,可大批量检测,具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于FAVⅠ的诊断、抗体水平监测及流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒黏液SIgA抗体ELISA检测方法的建立

旨在建立一种检测黏液中猪流行性腹泻病毒(PEDV)特异性SIgA的ELISA方法,从而评价PEDV黏膜免疫水平。首先将PEDV的S1D基因(534～789 aa)克隆至质粒载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,其表达产物以包涵体形式存在。Western-blot验证蛋白大小为32 ku,且具有抗原活性。再以8 mol/L尿素变性蛋白,经纯化、梯度复性后作为包被抗原蛋白,通过优化条件初步建立检测鼻腔和口腔黏液中PEDV特异性SIg A抗体的间接ELISA,并确定其最佳抗原包被浓度为2μg/m L;鼻腔黏液最佳稀释度为1∶1,最佳封闭液为50 g/L脱脂乳;口腔黏液最佳稀释度为1∶2,最佳封闭液为30 g/L BSA;酶标抗体最佳稀释度均为1∶2 000。最后应用该方法分别检测了84份已免疫猪的口腔、鼻腔黏液,其结果与以纯化的PEDV包被的间接ELISA相比,符合率达到95.2%。本研究中建立的检测黏液中PEDV特异性SIgA的方法简便快速,具有较好的敏感性、特异性,这为评价PEDV黏膜免疫水平提供了依据和检测标准。     

禽流感病毒NS1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立

以禽流感病毒(AIV)重组NS1蛋白作为检测抗原,兔抗NS1血清为阻断抗体,建立了检测AIVNS1抗体的间接阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原的最佳包被浓度为0.6 tμg/mL,阻断抗体的最佳稀释度为1:10 000,待检血清最佳稀释度为1:10.用该方法对42份AIV感染禽类血清样本和50份用AIV灭活疫苗免疫的禽类血清样本进行检测,结果显示,该方法的敏感性为95.2%,特异性为90.0%.交叉反应试验证明,该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应.临床检测结果显示,185份AIV灭活疫苗免疫禽血清样本的阴性率为89.2%,20份基因工程疫苗免疫禽血清样本的阴性率为95.0%,42份健康非免疫禽血清样本的阴性率为100%.表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于区分AIV自然感染禽和疫苗免疫禽.     

用间接ELISA法检测鸡痘病毒抗体的研究

建立了检测鸡痘病毒抗体的间接ELISA方法 ,用该法检测 2 0份人工感染鸡血清样品 ,抗体阳性率为 10 0 % ,康复期鸡群血清抗体阳性率为 4 3% ,人工接种弱毒疫苗 6 5d和 170d鸡群血清抗体的阳性率分别为 6 0 %、70 %。经反复试验 ,确定了诊断抗原的制备方法和间接ELISA检测鸡痘抗体的最佳反应条件 ,即抗原包被浓度 10 .8μg/孔 ,待测血清最佳稀释度为 1∶10 0。     

禽流感病毒M1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立

以禽流感病毒(AIV)重组M1蛋白作为检测抗原,兔抗M1血清为阻断抗体.建立了检测AIVM1抗体的间接阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原最佳包被浓度为0.78 μg/mL,阻断抗体最佳稀释度为1:15 000,待检血清最佳稀释度为1:10.用该ELISA方法对38份AIV阳性禽类样本和26份A1V阴性禽类样本进行检测,结果显示.该方法的敏感性为97.37%,特异性为96.15%.交叉试验证明该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应.用该ELISA方法对268份已知HI效价的临床样品进行检测,结果与HI的符合率达92%以上.表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于AIV抗体的检测和禽流感的流行病学调查.     

副猪嗜血杆菌不同血清型稳定表达蛋白的筛选及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种能够检测不同血清型副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA,选用了在4、5、12型副猪嗜血杆菌中稳定表达的3种蛋白经原核表达后作为候选抗原和全菌裂解物同时包被酶标板,对临床猪血清进行副猪嗜血杆菌抗体检测,发现以锰依赖的超氧化物歧化酶(MSD)作为包被抗原得到的结果最接近用副猪嗜血杆菌全菌裂解物进行ELISA检测的结果,故确定以MSD蛋白为抗原建立间接ELISA。通过方阵滴定对ELISA反应条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:包被抗原的质量浓度为1.5μg/mL,4℃过夜;50g/L脱脂奶粉溶液37℃封闭2h;血清稀释度1∶160,37℃作用90min;酶标二抗的稀释度为1∶15 000,37℃作用45min;底物显色时间为37℃6min。抗体临界值D450nm≥0.245 1判为阳性,D450nm0.208 3判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、红斑丹毒丝菌、马链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。用建立的间接ELISA对114份临床血清进行检测,与4、5、12型全菌裂解物的ELISA检测结果比较,阳性符合率分别为80.77%、80.00%和90.00%。结果表明,建立的间接ELISA可被用于4、5、12型副猪嗜血杆菌的抗体检测和流行病学调查。     

旋毛形线虫P53重组蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的旋毛形线虫P53排泄分泌(ES)重组蛋白作为包被抗原,建立了检测旋毛形线虫P53 ES蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件:抗原包被浓度为2/μg/mL(100 μL),血清稀释度为1∶200,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体稀释度为1∶10 000,抗原和血清于37℃反应1.5 h,血清和二抗于37℃反应1 h,底物于37℃显色10 min.应用该方法对试验小鼠血清进行检测,结果表明,建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性,适用于检测特异性P53血清抗体.     

小反刍兽疫病毒N蛋白主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为了建立可特异性地检测血清中抗小反刍兽疫病毒(PRRV)抗体的方法,对具有小反刍兽疫病毒特异性的N蛋白第Ⅳ区域进行扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,用于小反刍兽疫病毒N亚单位重组蛋白的表达。用纯化的重组蛋白作为检测抗原,建立了检测血清中抗小反刍兽疫病毒抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA的抗原包被量、血清稀释倍数、血清孵育时间等反应条件进行了优化。Western-blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的反应原性。所建立的间接ELISA方法可以鉴别血清中的小反刍兽疫病毒抗体和牛瘟病毒抗体,具有良好的特异性和灵敏性,与标准竞争ELISA试剂盒的符合率达98.4%。证实,本研究建立的检测血清中抗PPRV抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性和灵敏性。     

应用旋毛虫GAD和GLS重组抗原建立间接ELISA方法的研究

为了建立快速检测猪旋毛虫病的血清学方法,分别用旋毛虫GAD、GLS重组蛋白作为包被抗原,建立2种检测旋毛虫血清抗体的间接ELISA方法。对抗原包被条件、血清稀释度、封闭液的选择与封闭时间、酶标二抗的稀释度与孵育时间和TM B作用时间等条件进行了优化。旋毛虫GAD包被抗原间接ELISA方法和GLS包被抗原间接ELISA方法的阴阳性临界值分别为0.848和0.963;这2种间接ELISA方法批内和批间重复试验的最大变异系数均小于10%,且用这2种方法分别对猪蛔虫阳性血清、华支睾吸虫阳性血清和弓形虫阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明这2种方法具有很好的稳定性和特异性。同时用这2种间接ELISA方法和旋毛虫抗体快速检测卡分别对感染旋毛虫不同数量、不同时间的小鼠血清进行检测,结果显示,这2种间接ELISA方法具有较高的敏感性。本研究中建立的这2种间接ELISA方法为旋毛虫病的早期诊断和流行病学调查提供了必要的手段。     

猪流行性腹泻病毒抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用

用猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白单克隆抗体IgG包被酶标板,以纯化的PEDV作为捕获抗原,建立了PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法。优化后该方法的反应条件为:单克隆抗体包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h加4℃过夜;含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液作为封闭液,37℃封闭3h;捕获抗原的质量浓度为5μg/mL,37℃作用3h;被检猪血清做1∶50稀释,37℃作用1h;山羊抗猪IgG-HRP稀释度为1∶2 000,37℃作用45min;底物最佳作用时间为37℃10min。设定阴阳性血清抗体对照,计算血清样品的S/P值,S/P值≥0.37判为阳性,S/P值0.323判为阴性,介于两者之间为可疑。用建立的ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等阳性血清,结果均无交叉反应性。该方法的批间和批内变异系数均小于10%。相对国产商品化抗体检测试剂盒,其敏感性、特异性和符合率分别为94.6%、91.3%和93.3%。应用本方法检测山东、浙江和江苏省的308份猪血清样品,结果 PEDV抗体阳性率达89.29%。结果表明,建立的抗原捕获ELISA敏感性、特异性和重复性良好,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应30 min,底物在37℃显色15 min,D655 nm阴性、阳性临界值为0.5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验,表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测,结果显示,阳性血清的符合率为27.8%,阴性血清的符合率为91.7%。     

猪巨细胞病毒gB基因优势抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

扩增了猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因的优势抗原表位区,将构建成功的gB基因优势抗原表位区原核表达重组质粒(pET32a-gB)转化入表达菌Rosetta(DE3)中进行表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了一种检测PCMV抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA检测方法进行了优化。结果显示,最佳抗原包被浓度为1.9μg/mL,最佳血清稀释度为1∶160,二抗最佳稀释度为1∶10 000;当样品D450nm≥0.26时判为阳性,当样品D450nm<0.215时判为阴性,介于两者之间时判为可疑。用该间接ELISA方法对138份PCMV阴性血清与240份PCMV阳性血清进行检测的结果显示,它的特异性为97.83%,敏感性为97.9%,变异系数均小于10%。用该ELISA方法和Western-blot对184份临床样品进行检测,结果二者的符合率为92.4%。结果表明,该间接ELISA方法简便快捷,具有良好的特异性、敏感性及重复性,适用于对PCMV抗体的大规模检测。     

犬和猫狂犬病病毒抗体SPA-ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法扩增狂犬病病毒(RV)FluryLEP毒株N基因,将该片段克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,测序验证后将阳性重组质粒转化至宿主菌E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,RVN蛋白以包涵体形式表达,大小约为70ku,且该重组N蛋白具有良好的反应原性。用纯化的重组N蛋白作为诊断抗原建立了检测犬、猫RV抗体的间接ELISA方法,通过优化反应条件,确定抗原的最佳包被浓度为6μg/mL,血清最佳稀释度为1:200,SPA-HRP的最佳稀释度为1:2000。用该间接ELISA方法与以狂犬病病毒作为诊断抗原的商品化ELISA试剂盒分别对30份临床血清样品进行检测,结果两者的符合率为96.67%。表明基于重组N蛋白的间接ELISA方法可用于检测犬、猫RV抗体水平。     

鹅副黏病毒NP蛋白间接ELISA检测方法的建立及免疫鹅抗体水平的检测

以纯化的鹅副黏病毒NP蛋白为包被抗原,建立了检测鹅副黏病毒NP蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件:抗原包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释度为1∶200,兔抗鹅IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶2 000,抗原和血清、血清和二抗均于37℃反应1 h,底物于37℃显色15 min。此间接ELISA方法的特异性强、重复性好。应用该方法对试验鹅血清进行检测,以HI试验为参照。经统计学处理后,比较了两方法测得的抗体效价,分别建立了各组鹅群的回归方程。显著性检验证明,这两种方法检测的抗体效价呈显著相关关系。     

产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及间接ELISA的建立与应用

根据Gen Bank已登录的产气荚膜梭菌α毒素基因序列,设计并合成针对成熟肽的特异性引物。以C型产气荚膜梭菌总DNA为模板,PCR扩增α毒素成熟肽基因片段,构建原核表达重组质粒p ET-28a(+)-α。通过PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定后,将阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱导表达、镍柱亲和层析纯化蛋白、尿素梯度透析复性后,Western-blot鉴定表达产物。使用复性的重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA的试验条件,确定最佳反应条件。正交试验结果表明,抗原最佳包被浓度为5.0 g/m L,血清的最佳稀释度为1∶50,酶标二抗的最佳稀释度为1∶5 000。采用已确定的间接ELISA的反应条件,对108份阴性血清的检测结果进行统计学分析,确定了间接ELISA的判定标准,即D450≥0.393为阳性,D4500.393为阴性。采用已建立的间接ELISA对58份阴性血清和50份阳性血清进行检测,结果表明建立的间接ELISA的特异性为96.5%,敏感性为98%。采用本试验建立的产气荚膜梭菌α毒素抗体间接ELISA对陕西省不同山羊场的521份山羊血清进行了检测,阳性率为92.7%。上述结果表明,该间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用为产气荚膜梭菌α毒素抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

基于PLD蛋白的伪结核棒状杆菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立以PLD蛋白为包被抗原的伪结核棒状杆菌(C orynebacterium pseudotuberculosis,C p)血清抗体间接ELISA检测方法,以原核表达得到的重组PLD蛋白作为包被抗原,并进行特异性、敏感性和重复性试验,以及对临床样本进行检测。结果显示,重组PLD蛋白大小为33 ku,Western-blot检测具有良好反应原性;建立的间接ELISA检测方法最佳抗原包被量为每孔200 ng,血清以1∶200稀释作用1 h,酶标二抗以1∶5 000稀释作用1 h,TMB显色20 min,血清阴阳性临界值为0.367。特异性试验表明,建立的ELISA方法对羊布鲁菌、产气荚膜梭菌、羊结核、羊衣原体和小反刍兽疫阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;灵敏性试验表明,当C p标准阳性血清1∶1 280稀释时检测结果仍为阳性,灵敏性良好;重复性试验表明,批内和批间变异系数分别在2.27%～8.89%和2.11%～6.92%,重复性良好。对临床采集的山羊样本进行检测与实际患病情况的符合率为96%,符合率较高。对陕西省不同羊场的643份山羊血清进行检测,C p阳性率为31%。本研究建立的C p抗体检测方法为下一步研制C p抗体ELISA检测试剂盒提供了理论基础。