CD44受体分子对口蹄疫病毒感染的影响

为探索CD44分子在口蹄疫病毒(FMDV)感染中的作用,揭示FMDV的感染机制,为开发阻断FMDV入侵的药物和高效疫苗提供新靶点。采用Western-blot、TCID50检测、激光共聚焦显微镜检测等方法,检测FMDV感染BHK21细胞后CD44的表达水平,以及用抑制剂MβCD抑制CD44表达后对FMDV增殖的影响。Western-blot结果显示,FMDV感染BHK21细胞后,CD44的表达量显著上升(P0.05);用MβCD抑制内源性CD44表达后,FMDV的增殖水平显著降低(P0.05)。TCID50检测结果显示,用MβCD抑制CD44表达后,FMDV的表达显著降低(P0.05)。激光共聚焦结果显示,FMDV感染BHK21细胞后CD44的表达量上升。表明,CD44分子参与FMDV的感染过程,可能作为调控分子直接或间接参与FMDV的入侵过程,仍需要进一步研究。     

鼠源肿瘤转移抑制基因2的基因特征及亚细胞定位

运用蛋白质组学技术发现口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK21细胞致其肿瘤转移抑制基因2(NME2)蛋白上调表达,NME2基因在细胞增殖、生长、黏附和分化、细胞凋亡活动中发挥重要功能,蛋白质功能的发挥与其在亚细胞的定位密切相关。目前,为了解鼠源NME2的基因特征及其在BHK21中的亚细胞定位,笔者从BHK21细胞中克隆了鼠源NME2基因并进行了序列测定,比较分析了11种不同物种间NME2基因特征,建立了相应的系统进化树,构建了NME2真核表达质粒,转染BHK21激光共聚焦显微观察其亚细胞定位。结果发现,每个物种的NME2基因特征都有差异,且有一定的遗传进化距离,鼠源NME2基因在BHK21细胞中主要定位于细胞核。研究结果为了解不同物种间NME2基因的差异及其在FMDV感染BHK21细胞中的作用提供了依据。     

口蹄疫病毒A型SAP突变毒株的构建及其生物学特性的测定

为了获得对牛和猪低致病性或无致病性的口蹄疫(FMD)疫苗毒株,提高疫苗毒株的生物安全性,选择口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白酶编码基因SAP区域进行突变。利用反向遗传操作技术,构建FMDV SAP区域突变的A型病毒重组质粒prA-SAP-FMDV。利用脂质体将构建的重组质粒转染BHK21细胞,重组质粒能够致细胞病变(CPE)。连续传代后,经RT-PCR鉴定和间接免疫荧光试验等,SAP突变的重组病毒rA-SAP-FMDV被成功拯救。另外,比较测定了该重组毒与亲本毒rA-WT-FMDV对BHK21细胞和乳鼠的致病性;结果显示,rA-SAP-FMDV的TCID50/mL为10-7.17,LD50为10-6.5/0.2mL,与亲本毒株的生物学特性相似。这一突变SAP域的A型FMDV的获得为研发生物安全性高的A型FMD疫苗奠定了基础。     

金丝桃素体外抗高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒活性的研究

为研究金丝桃素体外对高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性的影响,以Marc-145细胞培养增殖的PRRSV为研究对象,通过噻唑蓝(MTT)比色法和观察细胞病变效应(CPE),测定吸光度值(D490nm)和半数细胞感染量(TCID50),以细胞存活率、病毒抑制率和TCID50为指标,评价不同剂量的金丝桃素体外抑制PRRSV活性的效应,并通过改变加药方式(同时、感染前、感染后给药).探讨其抗PRRSV的作用机制.结果表明,在PRRSV感染的同时加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率略有升高,与PRRSV对照组和拉米夫定对照组相比,均有显著性差异(P<0.01).在PRRSV感染前和感染后加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率明显升高,且随药物浓度的增加而上升,与PRRSV对照组相比,有显著性差异(P<0.01),与拉米夫定对照组相比无统计学意义(P>0.05).金丝桃素可使PRRSV的TCID50从6.1下降至4.15.证实,金丝桃素具有多环节体外抗PRRSV效应;不同浓度的金丝桃素表现出不同的抗PRRSV活性,并呈现剂量依赖关系.     

新型鸭呼肠孤病毒TH11株在BHK21细胞系中的增殖特性

为研究新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)在BHK21细胞系中的增殖规律,将NDRV野毒株TH11接种BHK21细胞系,连续传代3次后,观察病毒对细胞的致病变效应(CPE),并对病毒核酸及其蛋白的表达和病毒增殖特性进行了鉴定。结果显示,NDRV TH11株能够在BHK21细胞中有效增殖,并产生以细胞巨融合为主的典型CPE,病毒蛋白在细胞中也获得了良好表达,并与σC蛋白特异性抗体发生反应。一步生长曲线显示,TH11毒株感染BHK21细胞后第0~12小时为潜伏期,第12小时开始增殖,第12~36小时进入快速增殖期,第48小时病毒效价即达到最高,即TCID50为106.57/0.1mL,随后病毒的增殖随细胞的崩解而降低。上述结果为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞灭活疫苗奠定了基础。     

金丝桃素体外抗传染性支气管炎病毒的研究

将不同浓度的金丝桃素和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)以三种方式加入鸡胚肾细胞(CEK)培养体系中,采用细胞病变效应(CPE)法、MTT法、病毒滴度法、实时荧光定量PCR以及间接免疫荧光技术检测金丝桃素体外抗IBV作用,同时检测其对IBV诱发细胞凋亡的影响。结果显示,金丝桃素在CEK细胞感染IBV前、后及同时加入,都有明显抑制CPE的作用;随着添加药物浓度的增加,CEK细胞活力明显增高,病毒TCID50滴度、病毒核衣壳蛋白RNA相对表达量和CEK细胞中病毒阳性绿色荧光信号显著降低或减少(P0.01),并且呈现明显的剂量依赖性。三种给药方式以药物和病毒互作后同时加入效果最好。IBV可以引起CEK细胞凋亡的发生,添加金丝桃素能够抑制病毒引起的凋亡。上述试验结果表明,金丝桃素具有很好的抗IBV作用,其作用可能是通过抑制感染细胞凋亡产生的,这可能是金丝桃素抗IBV的作用机制之一。     

靶向脑心肌炎病毒VP1基因的shRNA对脑心肌炎病毒复制的抑制作用

选择脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因,探讨了shRNA对EMCV复制的影响。设计合成4对编码siRNA的VP1基因的DNA序列,分别构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体X109-1、X109-2、X109-3和X109-4,脂质体介导转染至BHK21细胞,接种EMCV。病毒TCID50和实时荧光定量PCR结果表明,4种重组EMCV VP1shRNA对EMCV的复制均有抑制作用,其中X109-2的抑制作用最显著。X109-2转染BHK21细胞后分别接种EMCV、口蹄疫病毒(FMDV)、乙型脑炎病毒(JEV),EMCV的lgTCID50为3.5,FMDV和JEV的lgTCID50均在7.0以上,说明重组shRNA质粒对EMCV复制的抑制具有明确的特异性和干扰的靶向性。X109-2和pEGFP-VP1真核表达载体共转染CHO-K1细胞后,RT-PCR和Western-blot检测结果表明,VP1shRNA可抑制pEGFP-VP1在细胞中的蛋白表达,进一步证明了干扰载体的靶向性。上述结果为进一步研究EMCV的感染和复制机制奠定了基础。     

FMDV在BHK_(21)细胞扩增后FMDV140S抗原的测定

本文报告了用蔗糖密度梯度离心和光密度分析相结合口蹄疫 病毒(FMDV)在单层BHK_(21)细胞中扩增后,其中FMDV 140 S抗原浓度,并同时分析了经BEI(二乙烯亚胺)灭活后,这种抗原含量的改变。结果表明,O型FMDV在单层BHK_(21)细胞中增殖后,其FMDV 140 S抗原浓度达1.2μg/ml;而经BEI灭活后,其中FMDV 140 S抗原浓度降至0.9μg/ml。     

金丝桃素可溶性粉体外抗犬瘟热病毒的试验研究

采用先药后毒、先毒后药和药毒同加3种不同的给药方式,分别在试验开始后第72 h和96 h观察犬瘟热病毒致Vero细胞的病变情况.结果显示,犬瘟热病毒的TCID_(50)为10~(-5.68)/0.1 mL,药物的TC_0为0.312 5 g/L;与对照组比较,药物浓度在0.039～0.312 5 g/L范围内先毒后药方式的细胞生长情况良好,细胞单层完整,视野中有极少量圆细胞或死细胞,而其余两种给药方式的细胞病变明显.结果表明,金丝桃素可溶性粉在先毒后药情况下可以有效抑制犬瘟热病毒的增殖.     

口蹄疫病毒Asia 1/JSWX株基因组全长感染性克隆的体外拯救与序列分析

通过反转录聚合酶链反应,获得了口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JSWX株基因组3′端长片段(长约7.5kb)和5′UTR中ploy(C)前后的2个短片段。5′UTR的2个短片段经融合PCR扩增得到长约710bp的片段。用引物在基因组5′末端引入AflⅡ酶切位点和T7启动子,在5′UTR内引入SpeⅠ酶切鉴定位点,在3′末端引入NotⅠ酶切位点,将融合片段和3′端长片段顺次连接到载体pSL1180。经T7体外转录系统获取的RNA转录本与脂质体共转染BHK21细胞。测序结果表明,构建的病毒基因组全长cDNA为8 197nt,分别包括1个长为1 095nt的5′UTR[含有1个17nt的ploy(C)];1个长6 990nt的ORF;1个长为93nt的3′UTR;之后是18nt的poly(A)尾巴。该全长cDNA克隆与Asia 1/Jiangsu/China/2005株基因组序列的同源性为98.4%。测序和酶切鉴定结果均表明,该口蹄疫病毒株全长cDNA克隆已构建成功,该方法极大地简化了获得FMDV全长cDNA克隆的过程。通过反转录聚合酶链反应、间接免疫荧光试验和蚀斑试验等鉴定,本试验获得了感染性分子克隆;体外拯救获得的基因工程病毒连续传代培养后,可致BHK21细胞产生病变。上述结果表明,构建的cDNA克隆可以作为基因操作的载体,为深入研究安全性好、稳定性高和免疫原性强的基因工程疫苗奠定了基础。     

一种制备复制缺陷型重组水疱性口炎病毒新方法的建立

为了提高复制缺陷型重组水疱性口炎病毒(VSV△G*G)的制备效率,对传统制备方法进行了改良,在制备过程中先用VSV△G*G转导细胞1h后,再对其进行转染,24h后收集细胞上清并进行毒价测定。并与用传统方法制备的重组病毒的毒价进行比较,结果表明,用改良方法与传统方法制备的重组病毒具有相同的毒价,但改良方法比传统方法节省了20～48h,同时减少了表达的G蛋白诱导细胞融合所造成的细胞损伤。表明改良方法能够代替传统方法制备出高毒价的复制缺陷型重组病毒。     

口蹄疫病毒Mya98谱系猪源及牛源2010年分离株的分子特征及蚀斑显型比较分析

为了明确口蹄疫病毒(FMDV)Mya98谱系猪源及牛源2010年分离株的分子特征及蚀斑显型差异,对采自不同宿主的4株FMDV进行了分子特征分析和蚀斑形态的比较。结果显示,来自不同宿主动物的分子特征差异主要表现为猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S2与2个牛源毒株之间具有21个特异性的氨基酸置换位点,分散在ORF范围内。猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S1具有与牛源毒株大量相似的氨基酸位点,并且与2株牛源毒株一样,都显示为小斑的蚀斑显型,而猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S2在蚀斑试验中显示为大小斑混合存在。结果表明,猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S2的变异位点对病毒蚀斑显型的改变具有重要意义。     

口蹄疫病毒结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒OLZ0 2株基因组序列为材料 ,采用Garnier Robson法、Chou Fasman法和Karplus Schulz法预测了其结构蛋白的二级结构 ,用Kyte Doolittle法分析了各结构蛋白的亲水性 ,Emini法预测了各结构蛋白的表面可能性 ,Jameson Wolf法预测了各蛋白的抗原指数 ,综合评价了口蹄疫病毒结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明 ,VP1蛋白含有的B细胞优势抗原表位最多 ,是研制口蹄疫基因工程疫苗的首选免疫原 ,但其他结构蛋白也含有少量的B细胞抗原表位 ,有的甚至有可能成为优势抗原表位     

口蹄疫病毒3D蛋白对DNA疫苗免疫效果的影响

将携带O型FMDVChina 99株P1 2A、部分 2B及 3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDVChina 99株 3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠。以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素 (PHA)刺激后的增殖活性 ,以间接ELISA方法检测血清FMDV特异抗体变化 ,并以微量中和试验检测中和抗体水平。结果表明 ,FMDDNA疫苗与 3D蛋白共同免疫豚鼠后 ,抗体水平没有明显提高 ,攻毒后的保护率为 2 5 %。     

RGD基序邻近氨基酸突变对口蹄疫病毒O/JC/2010株毒力的影响

为了研究RGD基序邻近氨基酸位点对口蹄疫病毒毒力的影响,利用O/JC/2010株病毒的基因组全长cDNA分子克隆,置换O/HN/93株病毒的VP1基因,拯救获得了1株嵌合病毒(pBlue-HJ);除此之外,在O/JC/2010VP1的3个氨基酸位点进行突变P142T、A152D、Q153P,分为4组,拯救出4株突变病毒:pBlue-HJ(142)、pBlue-HJ(142+152)、pBlue-HJ(152+153)、pBlue-HJ(142+152+153)。比较这5株病毒的LD50和TCID50特性,发现P142T、A152D可以增强口蹄疫病毒对BHK-21细胞和乳鼠的致病力,而Q153P则相反。该试验证明RGD基序附近的非保守氨基酸位点对口蹄疫病毒的毒力存在影响,为进一步阐明口蹄疫病毒的分子致病机制奠定了基础。     

口蹄疫病毒的纯化及鉴定

通过PEG 6 0 0 0沉淀 ,差速离心和蔗糖密度梯度离心等方法提取纯化了口蹄疫完整病毒粒子 (FMDV ) ,经 30g/L磷钨酸负染后电镜观察 ,FMDV 14 6S为中心黑染的圆形颗粒 ,与中心透亮的FMDV空衣壳有明显区别 ,SDS PAGE和Western blotting试验结果表明 ,FMDV 14 6S电泳出现VP1、VP2、VP3三条结构蛋白带 ,其中VP1和VP3与阳性血清发生反应出现 2条明显的条带。     

口蹄疫病毒多基因腺病毒穿梭质粒的构建

采用分步扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因P1 2A、3C蛋白酶基因和 3D聚合酶基因按正确的读码框依次连接克隆入 pGEM T载体。然后 ,将切取的目的基因亚克隆入腺病毒穿梭质粒 pShuttle CMV。构建成功的 2个重组穿梭质粒经测序鉴定 ,含有完整的目的基因表达盒 ,穿梭质粒可与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组 ,以产生重组腺病毒载体     

应用PCR检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒

设计合成了 1对引物 ,建立用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒的PCR方法。结果表明 ,PCR对羊接触传染性脓疱性皮炎病毒细胞培养毒的检测与细胞培养CPE、电镜检测的结果相一致。经对扩增产物进行序列分析 ,与已报道NZ 2株的核苷酸序列同源性高达 97%。用此PCR方法扩增羊痘病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒 ,结果均为阴性。此方法用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒是可行的、特异的     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

用灭活O型口蹄疫病毒为抗原免疫BALB/c小鼠4次后,取致敏的脾B淋巴细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,经间接ELISA法筛选,最终获得了3株抗O型FMDV的阳性杂交瘤细胞株,命名为2F1、2G7和6H4。血清学试验证明该McAbs能与FMDV抗原结合,具有高度特异性。     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。