Clade2.3.4 H5亚型禽流感疫苗变异候选株的构建

为应对Clade2.3.4H5亚型禽流感病毒持续发生的抗原性改变及其引发的潜在的地方性流行,需要根据流行监测的抗原分析结果制备疫苗候选株。采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV的内部基因为骨架,以Clade2.3.4H5N1亚型AIV A/chicken/Hebei/2/2011(wt-HB株)的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因为供体,并删除wt-HB株HA基因中编码多碱性氨基酸的序列,成功拯救出1株重组病毒rHB/PR8。该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖性能,对SPF鸡和鸡胚无致病性。这一研究结果为防控变异的Clade2.3.4H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株。     

两株家鸭禽流感病毒H3N1亚型分离株的致病性及其表面糖蛋白基因序列分析

测定了2株禽流感病毒(AIV)Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性；对其血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列进行了测定,并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果,此2株AIV对SPF鸡具有较低的致病性,而对BALB/c小鼠无致病性；Dk/YZ/231/02株的HA基因与Dk/Ukraine/1/63(H3N8)株的同源率最高,Dk/YZ/3/ 04株的HA基因与Petbird/HK/1559/99(H3N8)株的同源率最高；而Dk/YZ/231/02株的NA基因与Dk/Fujian/17/2001(H5N1)株的同源率最高,Dk/YZ/3/04株的NA基因与Gs/Guangdong/ 1/96(H5N1)株的同源率最高。进化分析结果表明,Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04株的NA基因均可能起源于水禽源H5N1亚型AIV,这可能是不同亚型AIV在水禽体内基因重组的结果。推导的氨基酸剪切位点序列均为PEKQTR,属于非高致病性AIV的特征序列。     

H9N2亚型猪流感病毒A/Swine/Shandong/1/02 分离株的基因序列分析

从有肺炎症状的病猪中分离到1株H9N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Shndong/1/02,对其进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因片段的核苷酸序列均来自禽流感病毒(AIV),与我国目前家禽中流行的H9N2亚型AIV毒株具有很高的同源性,与A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)的同源性为94.1%～98.9%,与A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)的同源性为94.5%～98.2%;推导的其血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为P-A-R-S-S-R,完全符合H9亚型AIV欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/1/94亚分支的特征;基因分析结果表明,该分离株的所有基因片段均来源于H9N2亚型AIV,它可直接感染猪,并导致发病,但它并未在猪体内发生重组.     

H7N2禽流感病毒分离株血凝素蛋白全基因的序列分析

为进一步分析H7N2禽流感病毒(AIV)分离株血凝素(HA)基因的特性,参照已发表序列设计了1对引物,采用RT-PCR获得了1条约1.7 kb的DNA片段,测序后进行了同源性比较、HA基因系统发育进化树分析和氨基酸编码分析。结果表明,所测的2个分离株的HA基因全长1 664 bp,编码除信号肽以外的HA蛋白的全部544个氨基酸,其中包括HA1的323个氨基酸,HA2的221个氨基酸。2个分离株HA基因核苷酸序列的同源性为99.4%;与GenBank中AIV标准株A/Afri.Star./Eng-Q/983/79(H7N1)的同源性最高,分别为99.4%和99.0%;与美国A/Chicken/NewYork/13142-5/94(H7N2)株同源性很低(仅65.0%),而与以色列、意大利H7N2AIV的同源性较高(为96%~97%);2个分离株在HA基因进化树中均处于H7亚型AIV的欧亚群系分支内。推导氨基酸的序列分析表明,其HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为-GR-GLF-,仅包含1个碱性氨基酸(R-)残基,符合低致病力AIV的基因特征。     

H7N9亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶单因子血清的制备

为获得特异性H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)单因子血清,根据GenBank中A/Chicken/Zhejiang/SD007/2013毒株的序列人工合成了HA基因和NA基因,然后将其分别克隆至真核表达载体pCAGGS,构建了重组真核表达质粒pCAGGS-HA和pCAGGS-NA,经酶切和测序鉴定后将阳性重组质粒转染COS-7细胞,利用H7N9AIV鸡血清进行Western-blot分析。结果显示,重组质粒中的目的基因均能够成功表达。将重组质粒以每只200μg的剂量免疫4周龄SPF鸡,二免后第14天采集血清并用间接免疫荧光试验和Western-blot检测抗体。结果显示,免疫鸡产生的血清均能与对应质粒经COS-7细胞表达的蛋白发生特异性反应。结果表明,成功制备的H7N9AIV HA蛋白和NA蛋白单因子血清具有良好的反应原性,为提高H7N9AIV的血清学检测方法的准确性提供了一定技术支撑。     

H5亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备Clade 2.3.2分支H5亚型禽流感病毒HA蛋白的单克隆抗体,以灭活的超速离心浓缩纯化的H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Guangdong/S1322/2010(DK/GD/S1322/2010)免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠。取免疫后小鼠脾细胞,使其与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,通过血凝抑制(HI)和ELISA方法筛选,共获得2株能够稳定分泌HA蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株A4和D11。2株单克隆抗体的重链均为IgG1,轻链均为κ链。经HI检测,A4和D11的细胞培养上清和腹水的抗体效价分别为23、22和211、211。HI和中和试验结果显示,这2株单克隆抗体与Clade 2.3.2.B分支和Clade 2.3.2.C分支的病毒反应性良好,而与Clade 2.3.4和Clade 7分支的病毒均不反应。间接免疫荧光试验结果表明,这2株单克隆抗体能够识别MDCK细胞内感染的H5亚型禽流感病毒DK/GD/S1322/2010。结果表明,本研究制备的2株单克隆抗体为H5亚型禽流感病毒的检测和诊断奠定了物质基础。     

H1N1亚型猪流感病毒HA基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的血凝素(HA)基因,测序后对HA基因进行了生物信息学分析。将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。诱导表达的HA融合蛋白分子质量约为94.0 ku,表达产物占菌体总蛋白的29.5%。经Western-blot分析证实可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。用纯化的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,成功筛选到2株针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体;ELISA结果表明,制备的SIV单克隆抗体ⅢF6A4C10与H1N1亚型SIV抗原具有特异的免疫反应性,为H1N1 SIV的鉴别诊断奠定了基础。     

禽流感病毒N1和N2亚型神经氨酸酶RT-PCR鉴别方法的建立

针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的禽流感病毒(AIV)N1、N2亚型神经氨酸酶基因设计了2对引物,建立了一种RT-PCR鉴别方法,其目的片段大小分别为358 bp、377 bp.经对A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/Turkey/England/N28/73(H5N2)、A/African starling/983/79(H7N1)和A/Turkey/Wiscosin/1/66(H9N2)病毒株的鸡胚尿囊液样品进行扩增,扩增片段的大小与预期大小完全相符.经对国内不同地区分离的16株AIV N1亚型和21株AIV N2亚型用RT-PCR方法检测,阳性检出率分别为87.5%(14/16)和95.2%(20/21);对50份样品进行盲检,准确率为98%(49/50).     

H5亚型禽流感病毒核蛋白基因重组质粒的构建及其在Hela细胞的瞬时表达

采用PCR技术从重组质粒pMel-NP扩增得到了禽流感病毒(AIV)A/Goose/Guang-dong/1/96(H5N1)株的核蛋白(NP)基因,将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。将提取的pVAX-NP阳性克隆转染Hela细胞,48 h后经间接免疫荧光试验和Western-blotting检测,NP基因在Hela细胞中已成功瞬时表达。表达产物的分子质量约为57 ku,它与H5N1亚型AIV多克隆抗血清有较好的免疫反应。     

H9亚型禽流感病毒分离株A/Chick/Shandong/6/96的基因序列分析

对1株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)A/Chick/Shndong/6/96(H9N2)进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因的核苷酸序列皆与1994年分离株A/Chicken/Beijing/l/94(H9N2)具有很高的同源性(96.0%-98.6%);推导其血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为A-R-S-S-R,完全符合H9 AIV欧亚分支中的类A/chicken/Beijing/1/94亚分支的特征;虽然其神经氨酸酶(NA)基因与A/Chicken/Beijing/l/94(H9N2)相比,出现了9个核苷酸的缺失,然而其同源性仍然较高,为97.3%;而与欧亚分支中的类A/Chicken/Korea/323/96和类A/Quail/HongKong/G1/97亚分支的同源性却相对较低,分别为92.0%和84.2%;其它基因的比较情况也大体相近.提示该毒株是由1994年分离株进化而来,在遗传演化上属于H9亚型流感病毒欧亚分支中的类A/Chicken/Beiing/l/94(H9N2)亚分支.     

几种动物病毒的基因芯片检测技术

分别用水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段构建质粒 ,在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸 ,经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果扫描检测 ,可同时对上述 7种动物传染病进行快速、准确的诊断 ,此方法敏感性高 ,特异性强 ,适合于大批动物高通量检疫。     

H5N1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中,构建重组转移载体pSY(NA+LacZ),将其转染鸡胚成纤维细胞,经蓝白斑筛选,纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA,用其免疫SPF鸡,检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示,该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白,表达产物的分子质量约为55 ku;用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后,能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明,重组禽痘病毒rFPV-NA具有良好的免疫原性。     

尼帕病毒病及其病原的研究进展

概述了尼帕病毒病在国外的流行状况、尼帕病毒(Nipah virus,NiV)的变异及我国的研究现状,着重阐述了近年来在其基础病毒学、诊断技术及防治方面的研究进展,主要包括病毒蛋白的功能及其相互作用、受体的发现、动物模型、荧光PCR及ELISA诊断技术、抑制NiV感染及治疗等方面的研究成果,为该病的深入研究提供了参考。     

表达狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒在犬体内的免疫效果

为研制一种新型有效的狂犬病重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,将酶切鉴定为正向连接的阳性重组子命名为p8AA-EGFP-rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得能够表达狂犬病病毒(RV)CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV/EGFP-rgp,经RT-PCR和Western-blot鉴定后对犬进行肌肉注射免疫,并测定相应试验指标,研究重组病毒对犬的免疫诱导情况.结果显示,重组病毒可以有效地刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;产生的针对RV的中和抗体水平[(0.95±0.21)U/mL]在14周时还保持相对国际最低保护标准(0.5U/mL)较高的水平;且产生的针对RV和PRV的中和抗体水平均达到了相应灭活疫苗和减毒活疫苗的水平,抗体效价均维持在14周以上.     

猪传染性胃肠炎病毒的血凝作用

将猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）Ａ株在ＩＢＲＳ２细胞上增殖，培养物经差速离心浓缩后与鸡红细胞出现了高凝集价（２８），这种凝集作用能被兔抗ＴＧＥＶ高免血清所抑制。试验的最适反应条件为体积分数０．５０％红细胞４℃作用１ｈ。通过反复试验，建立了一种简单实用的血凝抗原制备方法，病毒培养液不需浓缩可直接应用。     

应用PCR检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒

设计合成了 1对引物 ,建立用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒的PCR方法。结果表明 ,PCR对羊接触传染性脓疱性皮炎病毒细胞培养毒的检测与细胞培养CPE、电镜检测的结果相一致。经对扩增产物进行序列分析 ,与已报道NZ 2株的核苷酸序列同源性高达 97%。用此PCR方法扩增羊痘病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒 ,结果均为阴性。此方法用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒是可行的、特异的     

鸡马立克氏病病毒HC135分离株的致病性

从辽宁省某鸡场疑似马立克氏病发病鸡外周血淋巴细胞中分离到1株适应鸭胚成纤维细胞生长的马立克氏病病毒(MDV),经蚀斑克隆和细胞传代,成功培育了1株增殖性能稳定的MDV细胞毒株,命名为HC135株;将HC135株第4代细胞培养物分别人工感染非免疫和不同疫苗免疫的SPF鸡,分析其对鸡的致病力,分离毒株攻毒对照组鸡的发病率为100%(10/10),死亡率为30%(3/10);HVT疫苗及HVT/SB1双价疫苗对分离毒株的保护指数分别为22.2和40.0。结果表明,该毒株可以突破HVT疫苗和HVT/SB1双价疫苗的免疫保护,具有特超强毒株(vv+MDV)的特点;也证实了我国商品鸡群中存在vv+MDV毒株。同时比较了HC135株与14株参考毒株的Meq基因序列,发现其Meq基因的ORF内没有基因片段的插入或缺失,推导的氨基酸存在点突变,这种突变符合高毒力毒株的变异规律。     

屠宰猪肝和血清中乙型肝炎病毒及戊型肝炎病毒的检测

应用1对乙型肝炎病毒(HBV)S基因保守区的引物,采用PCR方法从屠宰猪肝、血清中检测到了HBV,序列分析表明,扩增片段与已发表的HBV S基因的同源性高达98%~100%。电镜负染色样品观察结果表明,在HBV表面抗原ELISA检测强阳性反应的血清样品中存在有形态、大小与人HBV Dane颗粒和小球状颗粒相似的病毒粒子。针对戊型肝炎病毒(HEV)ORF2/ORF3重叠区设计了简并引物,采用巢式RT-PCR对屠宰猪肝和血清样品进行了检测。结果表明,部分屠宰猪肝中存在HEV。     

马立克氏病病毒gB基因的克隆及重组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒 (MDV) 2 .8kbgB基因 ,并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ酶切位点。然后用PstⅠ /NotⅠ酶切回收 gB片段 ,插入到转移载体 pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ /NotⅠ酶切位点处 ,构建了转移质粒pEFgpt12s gB。将该质粒与鸡痘病毒 (FPV)野毒 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过MXHAT选择培养基进行筛选 ,蚀斑纯化 ,经PCR扩增证实重组病毒中含有 gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别 ,病毒效价分别为 10 -5.43 TCID50 /mL和 10 -6TCID50 /mL ,表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性     

鹅源H5N1禽流感病毒在感染雏鸡心脏的分布及所致病理变化

将120只1日龄SPF雏鸡随机分为对照组和7日龄(Ⅰ组)、21日龄(Ⅱ组)病毒感染组。Ⅰ组和Ⅱ组雏鸡分别于7和21日龄经鼻、眼、口感染鹅源H5N1亚型禽流感病毒(AIV)稀释液,3组雏鸡分别于感染后第1、3、4、5、7、14、21d或死亡前心脏采血,并快速采取心脏,应用免疫酶组织化学染色、常规HE染色及电镜观察等方法检测了AIV在感染雏鸡心脏内的分布,并观察了心脏的形态、病理变化。结果发现,雏鸡感染AIV后1～7d,心脏的血管内皮细胞和心肌纤维内均呈现病毒抗原阳性,并可见心肌不同程度的病理损伤。表明鹅源H5N1AIV对雏鸡心脏具有较强的组织嗜性,可能与其导致感染雏鸡死亡密切相关。