麋鹿朊蛋白全基因的克隆及序列分析

为获得中国麋鹿朊蛋白(PRNP)的全基因,并利用DNAStar软件与已报道的其他动物的朊蛋白全基因序列进行同源性分析,根据GenBank中马鹿朊蛋白基因序列设计特异性引物,采用PCR方法从提取的总基因组中扩增得到麋鹿PRNP基因;将其连接到pGEM-T Easy载体中,获得克隆产物并测序。结果,成功扩增出了中国麋鹿PRNP基因,构建了重组质粒pGEM-T-ML;对克隆产物的序列分析表明,麋鹿PRNP基因的开放阅读框包含771bp,编码256个氨基酸的前体蛋白,前体蛋白的分子质量约为28 200u;与已报道的其他鹿科动物朊蛋白全基因的核苷酸及氨基酸序列的同源性均在98.8%以上,与几种非鹿科动物的同源性在96.5%～98.4%之间。结果表明,麋鹿PRNP基因的核苷酸和编码蛋白的氨基酸序列与其他鹿科动物的序列具有高度保守性,而与几种非鹿科动物间的同源性也较高,说明朊蛋白是一种古老的高度保守的蛋白。     

食蟹猴和猕猴朊蛋白基因的克隆与序列分析

以外周血液的基因组DNA为模板,运用PCR方法扩增了食蟹猴和猕猴的朊蛋白基因,并将其克隆到pGEM-T Easy载体中进行测序,运用分子生物学软件对这些序列进行了分析.结果表明,所克隆的食蟹猴和猕猴朊蛋白基因的开放阅读框片段包含了朊蛋白基因的完整编码区,含有762个核苷酸,该基因内无内含子,编码253个氨基酸的前体蛋白,推测其分子质量约27.6 ku.与已报道的其他多种动物朊蛋白基因序列做比较,发现其与多种哺乳动物都有较高的同源性,其中与人的同源性最高.氨基酸点突变分析除发现了已报道的多态性位点N97S、H100N外,在食蟹猴和猕猴均发现了未报道的S242L点突变位点.此外,在食蟹猴还发现了I8M、C151R点突变位点.     

马麝朊蛋白基因的克隆与原核表达

为了解马麝朊蛋白基因的结构特征和其细胞型朊蛋白的性质,应用分子克隆和DNA重组技术进行了马麝朊蛋白基因的克隆、序列分析及其原核表达.序列分析表明,马麝朊蛋白基因编码区是包含在单一外显子内的完整开放阅读框,全长为771 bp,与马鹿、白尾鹿以及乳牛和绵羊朊蛋白基因相比,核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分别为97.3%～98.1%和97.7%～98.8%,说明朊蛋白基因在同科和不同科的反刍动物间是保守的;成功构建了马麝重组朊蛋白(85～233 aa)原核表达栽体pGEX-MuPrP(85～233),并转化E.coli BL21(DE3),获得重组表达菌E.coli GST-MuPrP(85～233),该重组菌可产生预期大小约为42.4ku的融合蛋白GST-MuPrP(85～233),在优化表达条件下,可产生占细菌总蛋白量30%以上的融合蛋白,免疫印迹检测显示表达蛋白可与抗牛单克隆抗体4C11反应,表明该基因的各氨基酸突变并未影响其单抗4C11的识别表位.     

双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白(PrP)基因,并克隆到pMD 18-T载体。序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同。4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽(九肽)重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸(除LT200302为23个氨基酸外)的C-端信号肽。4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%~100.0%和94.2%~100.0%。共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变。     

三种哺乳动物朊蛋白基因的克隆与分析

以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法克隆了汉族人、秦川黄牛和甘肃土种绵羊的Prnp基因,运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明,获得的3种哺乳动物的Prnp基因均位于1个单一的外显子内,与GenBank中登录的相应序列具有高度同源性,达99.0%。牛与绵羊Prnp基因同源性为97.3%,推导氨基酸序列同源性为96.5%。人Prnp基因与黄牛和绵羊Prnp基因的同源性分别为86.7%和87.1%,其氨基酸序列的同源性均为90.0%。3种Prnp基因均有富含G-C的重复区,编码的PrP蛋白均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPⅠ锚结合位点组成。基因型分析表明,秦川黄牛和甘肃土种绵羊可能存在感染海绵状脑病的风险。     

武威驴PrP基因序列与结构特征的分析

以武威驴朊蛋白(PrP)基因序列与结构特征分析为基础,通过比对找到奇蹄动物与偶蹄动物之间PrP基因的差异,探究朊病毒病在奇蹄动物与偶蹄动物之间传播的种间屏障及其形成机制。分别从8头武威驴全血中提取基因组总DNA,用设计的特异性引物以聚合酶链反应扩增出细胞型朊蛋白基因(PrPC),并将其克隆到pGEM-T Easy载体。测序之后使用生物信息学方法与软件进行相关分析。序列测定分析表明,所克隆的武威驴PrP基因片段的大小为768bp,包含了驴PrP基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框。本次克隆的武威驴PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码九肽/八肽PQGGGGWGQ/PHGGGWGQ重复子。8个驴PrP基因之间核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别介于99.2%~99.8%和98.4%~100%之间。武威驴与西吉驴、马之间PrP基因序列的同源性分别为99.2%和98.7%,与牛、绵羊、马之间PrP基因C端约100个残基区域的三级结构的相似性分别为91.84%、92.04%和97.35%。结果表明,奇蹄动物与偶蹄动物之间PrP基因存在明显的差异与进化分歧。     

北京鸭Ⅱ型干扰素基因分子克隆与序列分析

应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激培养的北京鸭脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增得到北京鸭Ⅱ型干扰素(1FN-γ)基因(DuIFN-γ2).序列分析表明,DuIFN-γ2基因长度与报道的鸭IFN-γ基因(AF087134)长度一致,为497个核苷酸,共编码145个氨基酸的成熟蛋白,推测其分子量约17 ku.两者核苷酸水平的同源性为99.6%,有2个位置发生非同义变异,其氨基酸序列的同源性为98.6%;与其他禽类的同源性为67.0%-68.0%,与人的同源性为34.4%.     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA ,根据已报道的猪瘟病毒基因组序列 ,设计合成了 2对引物 ,以总RNA为模板 ,利用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)、套组聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术 ,对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的 5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定 ,用DNAstar软件比较分析了 5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株 (C ST株 )E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现 ,5株野毒与C ST株核苷酸序列的同源性为 81.7%～ 83.1% ,氨基酸同源性为 87.3%～ 88.6 % ,表明它们之间存在较大的差异 ;但 5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达 98.8%～ 99.3% ,氨基酸同源性为96 .6 %～ 99.2 % ,表明它们之间的差异较小     

鸡IL-2受体α亚基成熟蛋白基因的克隆及其胞外段的原核表达

以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆了鸡白细胞介素-2受体α亚基(ChIL-2Rα)编码区基因。将ChIL-2Rα胞外段基因克隆到pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-exChIL-2Rα,转化宿主菌E.coli RossetaTM(DE3)后,经IPTG诱导表达的融合蛋白大小约为34 ku。序列分析发现,鸡IL-2Rα编码区基因与GenBank上已登录序列的核苷酸同源性为99.2%,氨基酸同源性为99.5%。ChIL-2Rα与其他哺乳动物IL-2Rα在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为29.6%~54.5%和18.8%~28.0%。表明,禽类IL-2Rα与哺乳类的差异较大。     

德州足螨副肌球蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的绵羊瘁螨副肌球蛋白基因序列(登录号为AM114275)设计了3对引物,采用RT-PCR法从德州足螨总RNA中克隆了副肌球蛋白基因,研究了该基因与部分螨类副肌球蛋白基因的同源性以及推导的氨基酸序列之间的同源性.结果显示,该基因全长2 628 bp,编码875个氨基酸,预测分子质量约为97.24 ku.与已报道的绵羊瘁螨、欧洲尘螨、美洲尘螨、人疥螨和热带无爪螨的副肌球蛋白基因同源性分别为95.5%、90.5%、89.4%、82.6%和79.5%,推导的氨基酸同源性分别为98.0%、97.0%、98.0 %、94.0%和89.0%.     

猪带绦虫六钩蚴TSOL16基因的克隆与序列分析

利用RT-PCR技术,从猪带绦虫六钩蚴中成功地克隆了TSOL16基因。序列分析表明,猪带绦虫六钩蚴TSOL16基因的开放阅读框(ORF)为402 bp,编码134个氨基酸,与报道的T.ovisTO16基因同源性为95.9%,推导的氨基酸序列同源性为92.6%。同时利用生物信息学和分子生物学软件对TSOL16基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明该蛋白为一结构松散的球状蛋白。     

新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

设计了 2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约 4 .1kb的V 4LA片段 ,用V4L3、V4L4扩增出约 3.5kb的V 4LB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接 ,得到长约 7.2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为 6 70 4bp ,拥有 1个 6 6 15bp的开放阅读框 ,推测其编码的氨基酸数为 22 0 4个。氨基酸同源性分析表明 :V4克隆株与HB92V4株L基因的同源性为 99.0 % ,与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株 )、BeaudetteC、Clone30、F4 8E9、SF0 2和ZJ1株的同源性为 94 .1%～96 .5 %。     

D28k钙结合蛋白cDNA的克隆及序列分析

利用RT PCR技术从鸡小肠组织RNA中扩增鸡D2 8k钙结合蛋白cDNA ,以进一步研究D2 8k钙结合蛋白促进肠钙吸收的机理。结果表明 ,鸡肠道D2 8k钙结合蛋白cDNA的开放阅读框由 789个碱基对组成 ,编码由 2 6 2个氨基酸组成的多肽 ,分子质量约为 2 7.9ku ;禽类D2 8k钙结合蛋白基因长 18.5kb ,10个间插序列将其分成 11个编码外显子 ,启动子区以GC为主 (6 0 %～80 % )。D2 8k钙结合蛋白氨基酸序列的同源性在鼠和人之间达到 98.5 % ,在蟾蜍和鸡之间达到80 .9% ,在人和鸡之间为 79.8% ,在鼠和鸡之间为 79.5 %。不同种属的动物之间D2 8k钙结合蛋白的氨基酸序列存在较高的同源性。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS基因的克隆及序列分析

采用RT PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示,分离毒株间的核苷酸同源率为90.2%～98.7%,氨基酸同源率为82.6%～97.8%。与其他毒株比较A Goose HLJ P46 2003(H5N1)和A Goose HLJ G2 2003(H5N1)株NS基因在第264～278位处发生了15个核苷酸缺失;A Goose Jilin W2 2004(H5N1)株NS1基因蛋白编码区的第652位碱基发生T C突变,成为终止密码子,造成NS1蛋白的C末端有13个氨基酸缺失。证实不同基因型的H5N1亚型禽流感病毒在我国家禽中同时存在;H9与H5亚型流感病毒基因间存在着广泛的遗传交换。     

鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒 (GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPVH1株VP1的 1对引物 ,利用PCR技术扩增出长约 2 .2kb的目的片段 ,将其克隆到 pMD 18 T载体上 ,进行了序列测定及分析。测序结果表明 ,GPVH1株VP1基因由 2 199个核苷酸组成 ,编码 732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较 ,核苷酸的同源性分别为 98.5 0 %和 93.18% ;推导的氨基酸同源性分别为 98.0 9%和 95 .77%。     

禽脑脊髓炎病毒 VP3基因的克隆与序列测定

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒 (AEV)序列设计了 1对引物 ,利用RT PCR技术 ,从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑以及内脏器官组织中成功扩增出了VP3基因 ,回收、纯化后克隆到T载体中 ,用常规方法转化JM1 0 9感受态细胞。阳性重组质粒经酶切及PCR鉴定后测定核酸序列。结果表明 ,VR株VP3基因全长 73 5bp ,共编码 2 4 5个氨基酸 ,与AEV 1 1 4 3标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为 93 .0 %和 97.0 % ;并将其与其他小RNA病毒进行了比较     

禽流感病毒N8亚型神经氨酸酶基因的克隆和全序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒A/Duck/Australia/341/83(H15N8),通过RT-PCR获得了NA基因全长,连接并转化,增菌培养后,提取阳性质粒进行序列测定,获得了禽流感病毒N8亚型的NA基因序列,分析了NA8基因与其他流感病毒神经氨酸酶基因的相互关系。结果显示,所获得的NA基因片段全长1459bp,最大开放阅读框编码457个氨基酸残基,经Blast分析,该基因与GenBank中其他13株N8亚型毒株的NA基因核苷酸序列同源性为91.6%～73.3%。与其他8个N1～N9亚型NA基因进行遗传演化分析,N8亚型与N5亚型NA基因的亲缘关系最近,与N3亚型NA基因的亲缘关系最远。结果表明,禽流感病毒N8亚型NA基因序列的测定对N8亚型流感病毒的诊断和预防具有重要意义。     

广西猪瘟流行毒株E2基因的序列分析

对从广西南宁和柳州分离的 2株猪瘟病毒E2基因进行了测序。应用DNAstar序列分析软件对所测 2个毒株GXNN、GXLZ的E2基因序列与猪瘟兔化弱毒株和石门 (Shimen)株进行了比较分析。结果显示 ,GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株核苷酸序列的同源性分别为 82 .1%和 82 .6 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 87.9%和 88.7% ;GXNN、GXLZ株与Shimen株核苷酸序列的同源性分别为 83.6 %和 84 .0 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 89.3%和 90 .1%。GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株和Shimen株的核苷酸序列和氨基酸序列都有明显差异。     

猪水泡病病毒结构蛋白编码区核苷酸的序列测定与分析

以猪水泡病病毒 (Swinevesiculardiseasevirus ,SVDV)HK’70为材料 ,用特异性引物扩增出P1区的 2个重叠目的片段 ,连接于pMD 18 T载体 ,转化JM 10 9感受态细胞。经重组质粒的双酶切 ,PCR鉴定后测序。序列分析表明 ,HK’70P1区核苷酸组成中A含量较高 ,G C含量较低 ,且A G、C T转换率较高。P1序列同源性分析表明 ,SVDVHK’70与J1’73、H/3’76、SVDV(Seechurn等测株 )、NET/1/92的核苷酸序列同源性分别为 97.8%、98.1%、97.6 %和 89.3% ;相应地 ,推导的氨基酸序列同源性分别为 98.8%、98.7%、98.8%和 96 .5 %。     

犬瘟热病毒TN野毒株核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的犬瘟热病毒(CDV)Onderstepoort株核蛋白基因(N)序列,设计了1对特异性引物,用该引物对分离的TN野毒株进行了RT PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM T质粒连接,得到重组质粒pTN。经核苷酸序列测定,CDVTN株N基因的ORF全长1569bp,编码523个氨基酸;将TN野毒株与GenBank中收录的其他CDV毒株进行比较,N基因核苷酸序列的同源性为94%～99%,推导的N蛋白氨基酸序列的同源性为97%～99%。TN株与Onderstepoort疫苗株氨基酸序列的差异主要集中在N端(17～159位)和C端(408～519位),中间的区域则高度保守。此外,在CDVN蛋白N端281～289位上也发现存在与麻疹病毒(MV)N蛋白完全相同的Y P A L G L H E F9肽序列,推测可能是诱导CTL活性的靶蛋白的抗原表位之一。氨基酸组成分析发现,推导的N蛋白氨基酸序列中亮氨酸、丝氨酸和异亮氨酸所占比例很高,提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构。