鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其对应抗原表位区的分析

为获得抗鹅细小病毒(GPV)VP1蛋白的单克隆抗体,以纯化的VP1蛋白为免疫原,免疫4～6周龄的雌性BALB/c鼠,经4次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,共获得5株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。Western-blot结果表明,这5株杂交瘤细胞分泌的抗体均能特异地与纯化后的GPV-VP1重组蛋白发生反应,单克隆抗体亚型鉴定结果表明,3株单抗为IgG1亚型,1株单抗为IgG2b亚型,1株单抗为IgA亚型,轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析,结果鉴定出3个抗原表位识别区,分别位于VP1的第92～123、92～145和111～145aa。证实,这5株杂交瘤细胞在体外长期培养能稳定地分泌抗GPVVP1的单克隆抗体。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定

为进一步研究牛IFN-γ(BoIFN-γ)单克隆抗体在牛免疫学以及牛疫病诊断中的应用,用原核表达的重组牛IFN-γ(rHis-BoIFN-γ)免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,免疫3次后取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经3～5次亚克隆,最终获得12株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株。Ig亚类鉴定结果显示这12株杂交瘤细胞均为IgG,其中5株为IgG1,3株为IgG2a,4株为IgG2b。这12株杂交瘤细胞在体外具有稳定分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的能力。Western-blot及间接ELISA证明这12株单克隆抗体均可特异性地结合rBoIFN-γ蛋白。间接免疫荧光试验显示,这12株单抗均与真核细胞BHK-21表达的rBoIFN-γ产生荧光反应,证明这些单抗能够与接近天然的BoIFN-γ反应,证实了单抗的特异性。ELISA叠加试验表明,3C2与1H4、1G6与1G4针对不同表位,1A10、1B2、2B9、3C4四株和1C1与1G6、1G4与3C2、1A10与1G8针对相同或相近的表位。     

马流感病毒NP单克隆抗体的制备及特性鉴定

利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原,经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经4次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得了3株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11、3E10和4A1,并对它们进行了亚类鉴定、间接ELISA检测和特性鉴定。结果显示,单抗2G11为IgG1亚型,3E10为IgG2a亚型,4A1为IgM亚型,轻链均为κ链。单抗2G11、3E10和4A1的细胞上清液及腹水效价分别为1∶640、1∶640、1∶320和1∶409 600、1∶204 800、0。这3株单抗均能特异性识别EIV NP重组蛋白,并且能够与天然EIV结合;获得的3株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。亲和力试验结果显示,单抗2G11和3E10与EIV的亲和力常数分别为4.39×106 M-1和2.20×106 M-1。     

肠出血性大肠杆菌VT1B亚单位的重组表达及其单克隆抗体的制备

为制备抗肠出血性大肠杆菌(EHEC)VT1B亚单位的单克隆抗体(McAb),以大肠杆菌EDL933的基因组DNA为模板扩增VT1B基因,纯化后经BamHⅠ和XhoⅠ酶切,连入表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-VT1B,转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,实现了融合蛋白的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的27%。重组蛋白纯化后,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,获得3株融合细胞1G11、2H8、1B10,Western-blotting表明,此3株单抗能与VT1B蛋白特异性结合而与载体蛋白不反应。Ig亚类分别为IgG1、IgG2a和IgG2b,染色体数均大于100,腹水单抗ELISA抗体效价大于1∶256000,亲和常数分别为0.54×108M-1、0.95×108M-1、0.33×107M-1,间接ELISA叠加试验初步鉴定结果表明,这3株单抗针对的是同一抗原表位。此3株特异性单抗的获得为VT1毒素的检测奠定了基础。     

用重组腺病毒免疫方法制备伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体

将表达伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gC基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gC蛋白的特异性抗体。给BALB/c小鼠用大肠杆菌表达的gC融合蛋白MBP-gC-NC加强免疫后第3 d,取小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行杂交融合,经筛选、克隆,获得了3株稳定分泌抗PRV gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1H4和2C8。单抗特性分析结果表明,1B4、2C8属IgG2a亚类,1H4属IgG1亚类;腹水抗体的ELISA效价为1∶2×105~1∶2×106;3株单抗都具有间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blotting)反应特性,能够特异地识别PRV gC蛋白。证实重组腺病毒免疫可用于制备目的蛋白单克隆抗体,为制备单抗提供了一种新的方法。     

鸡IFN-γ单克隆抗体的制备及其识别区的鉴定

IFN-γ是鸡体内一种重要的细胞因子,为制备鸡IFN-γ的单克隆抗体,以ch IFN-γ-His融合蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后分离出脾细胞与骨髓瘤细胞系(SP2/0)进行融合,经单克隆培养,筛选得到4株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2A10、2B10、4D10和4F9。应用间接ELISA方法鉴定4株单抗的重链类型分别为IgG2a、IgG1、IgG1和IgG2b。通过间接ELISA方法测定4株单抗的亲和力解离常数(Kd)分别为1.06×10~(-10)、7.35×10`(-10)、1.10×10~(-10)和9.34×10~(-10),表明4株单抗均为高亲和力抗体。将ch IFN-γ的C端、N端同时进行表达,应用Western-blot方法鉴定4株单抗的抗原识别表位分别为chIFN-γ的47-100位氨基酸,101-145位氨基酸和1-46位氨基酸。应用Western-blot方法鉴定4株单抗的特异性,4株单抗均能识别原核表达的重组蛋白chIFN-γ,而不识别鸡ch IL-2、ch IL-4、ch IL-10蛋白,表明4株单抗特异性良好。原核表达chIFN-γ蛋白制备单克隆抗体效果良好,为进一步研究chIFN-γ的功能奠定了基础。     

抗弓形虫MIC3单抗的制备及其在速殖子免疫荧光观察中的应用

为开展弓形虫速殖子阶段蛋白表达和定位的相关研究,利用弓形虫重组微线体蛋白3(MIC3)抗原研制单克隆抗体,筛选出适合在虫体内用免疫荧光观察该蛋白的单抗分泌株,建立了弓形虫间接免疫荧光观察方法。结果显示,经4轮亚克隆后得到3株稳定分泌抗MIC3单抗的分泌株:4G1、1G12和5D7;经测定,3株MIC3单抗4G1、1G12和5D7的亚型分别为IgG1、IgG2b、IgG2b,效价分别为1∶3 200、1∶12 800、1∶1 600。筛选得到的2株MIC3单抗(4G1和1G12)可用于间接免疫荧光检测MIC3蛋白在虫体中的分布。通过弓形虫阳性感染猪血液样品推片的免疫荧光试验,验证了这3株单抗具有特异性。结果表明,研制的MIC3单抗和虫体荧光观察体系可用于速殖子MIC3蛋白在虫体表达定位和其他研究,也可作为其他速殖子抗原荧光观察的比较对象。     

猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA法对融合细胞进行筛选,采用有限稀释法对阳性细胞进行4次亚克隆,获得了3株能稳定分泌N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3.分别采用体外培养法、诱导腹水法和实体瘤法制备单克隆抗体,并用间接ELISA法检测其效价,结果显示,这3株杂交瘤细胞的细胞培养上清、小鼠腹水和血清的单抗效价均分别为1:512、1:10~5、1:10~5,其中以诱导腹水法制备的单抗产量和效价最佳.间接免疫荧光试验结果显示,这3株单抗均能与TGEV感染的ST细胞产生特异性免疫荧光,而不与猪细小病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒等发生交叉反应;经鉴定,3株单抗的亚类均为IgG2a,这3株杂交瘤细胞具有良好的遗传稳定性.     

赤羽病病毒核衣壳蛋白原核表达及单克隆抗体制备

为制备赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳(N)蛋白单克隆抗体,本研究构建了pET-28aAKAV-N重组质粒,并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和镍柱纯化获得重组N蛋白。用重组N蛋白4次免疫小鼠后,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,利用亚克隆技术和ELISA方法筛选出4株阳性细胞株,分别命名为2D3、5F10、1F4和5D4,并对其进行特异性分析。免疫印迹(Western-blot)结果显示,2D3仅识别AKAV-N蛋白,5F10、1F4和5D4均能够同时识别AKAV-N和施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)N蛋白;间接免疫荧光(IFA)结果显示,2D3、1F4和5D4与AKAV感染的BHK21细胞呈阳性反应,而5F10为阴性。亚型检测结果显示,2D3抗体为IgG2a/к型,5F10、5D4抗体为IgG1/к型,1F4抗体为IgG1/λ型。综上所述,本研究获得的单克隆抗体能够为AKAV-N蛋白的相关研究提供支持。     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。     

猪瘟病毒NS3蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

以含有猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA的重组质粒pOKShimen为模板,经PCR扩增获得NS3基因,利用原核表达载体pMAL-c2X、pET32a以及杆状病毒表达载体pFastBacH T B表达CSFV石门株NS3基因,获得3种重组蛋白:MBP-NS3、His-NS3和rNS3。Western-blot分析及间接免疫荧光试验证实,这3种不同载体表达的NS3蛋白均能被猪瘟阳性血清所识别。利用直链淀粉树脂柱对重组蛋白MBP-NS3进行纯化后,用其免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA筛选,获得2株能稳定传代并分泌针对抗CSFVNS3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为1D10和1H10。Western-blot分析及间接免疫荧光试验结果证明,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可识别CSFVNS3蛋白。     

猪圆环病毒2型感染裸鼠及BALB/c小鼠的研究

用猪圆环病毒2型(PCV2)经腹腔注射BALB/c小鼠及裸鼠各15只,每隔2周1次,共感染3次。BALB/c小鼠初次、再次感染后均未出现明显的临床症状,仅有2只小鼠出现病理变化;从血清中可检测到PCV2核酸及其ORF2抗体;同时淋巴细胞增殖反应显著增强,NK和CTL细胞杀伤率显著升高;CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞及CD19+B淋巴细胞数量显著减少。裸鼠也未出现明显的临床症状,从血清中可检测到PCV2核酸,但未检测到PCV2 ORF2抗体;除NK细胞杀伤率显著升高外,其余免疫学指标无显著改变。结果表明,BALB/c小鼠比裸鼠对PCV2易感,各项免疫学指标变化与PCV2感染猪一致,但不表现临床症状,仅个别BALB/c小鼠出现病理变化,说明BALB/c小鼠对PCV2不如猪易感。     

猪囊虫TS21抗原DNA接种小鼠的免疫应答

将 4 0只BALB/c小鼠随机分为 2组 ,A组以VR10 2 0免疫作为对照 ,B组以TS2 1抗原基因的真核表达型质粒VTS2 1免疫。用ELISA检测免疫小鼠IgG总量和特异性抗体水平 ,MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞伴刀豆蛋白A(ConA)刺激的增殖反应及IL 2的诱生活性 ,常规法检测外周血免疫细胞数量的动态变化。结果显示 ,VTS2 1免疫小鼠血清的IgG含量和特异性抗体效价显著高于对照组小鼠 ;免疫小鼠脾淋巴细胞ConA刺激增殖反应和IL 2诱生活性均比对照组小鼠显著增强 ;免疫小鼠的淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞的数量也显著超过对照组。免疫小鼠的细胞和体液免疫反应显著增强 ,表明VTS2 1具有很强的免疫激活作用 ,有进一步研制开发成为猪囊虫病DNA疫苗的潜力     

应用BALB/c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB/c小鼠,同时设空白对照组,每组8只。免疫后每7 d采血一次,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测血清抗体水平;第28 d用800LD50同源强毒攻击,攻毒后36 h,每组随机选取3只BALB/c小鼠,采全血,分别用每只BALB/c小鼠全血注射12只乳鼠,每组共注射36只乳鼠,以乳鼠试验判定BALB/c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明,免疫组BALB/c小鼠均可产生特异性抗体,保护率分别为75.0%、63.9%、36.1%;对照组小鼠血清抗体为阴性。提示,BALB/c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。     

番鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的原核表达的番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σB蛋白为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,通过间接ELISA、Western-blot和免疫组织化学试验进行筛选及鉴定.结果显示,获得4株能够稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3F、B2B、C3E和D2G),其亚型分别属于IgG2b、IgG2b、IgM和IgM.采用小鼠体内诱生法制备的腹水均能与MDRV的σB蛋白发生特异性反应,表明,制备的单克隆抗体能够识别天然构象的σB蛋白.     

盖塔病毒6K蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为用于猪群中盖塔病毒(Getah virus,GETV)的流行病学调查,并研究其6K蛋白功能,制备了该蛋白的单克隆抗体。将6K基因克隆至原核表达载体pCold-TF,并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG低温诱导表达。将诱导的重组菌超声裂解,离心后收集上清,经过镍柱亲和和切胶纯化后,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。使用间接免疫荧光(IFA)法筛选阳性杂交瘤细胞,获得1株GETV 6K单克隆抗体,命名为25C5。将其注射小鼠腹腔,制备6K单抗腹水。IFA检测结果显示,单抗25C5可以结合GETV蛋白并产生特异性荧光。在Western-blot和免疫沉淀试验中,单抗25C5可以结合GETV感染的ST-R细胞样品,其特异性条带大小约6 ku。以上结果表明,单抗25C5免疫学反应特性良好,可用于检测GETV,为该病毒的分离鉴定、致病机制和蛋白功能等研究奠定了基础。     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

用灭活O型口蹄疫病毒为抗原免疫BALB/c小鼠4次后,取致敏的脾B淋巴细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,经间接ELISA法筛选,最终获得了3株抗O型FMDV的阳性杂交瘤细胞株,命名为2F1、2G7和6H4。血清学试验证明该McAbs能与FMDV抗原结合,具有高度特异性。     

猪瘟病毒石门株E2蛋白的单抗制备及抗原表位鉴定

用猪瘟病毒石门株E2(SM-E2)的BC区原核表达蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单抗,测定其效价并鉴定抗原表位。结果表明,制备了1株持续、稳定分泌抗SM-E2的单克隆抗体2B10,效价在1∶600～1∶1 000之间。单抗2B10能与常规SDS-PAGE转膜的SM-E2蛋白发生反应,表明其识别的是线性表位,并且该单抗只能识别石门毒株,而不能与C株疫苗及2型流行毒株发生反应。点突变E2蛋白ELISA分析结果表明,该单抗不与707、709、711、713和714位突变蛋白发生反应,表明单抗2B10识别的线性表位为707I-X-P-X-G-X-G-G714。该单抗对猪瘟病毒抗原多样性分析和致病机制研究有一定的应用价值。