线粒体16SrRNA和Cytb基因复合扩增进行种属鉴定

目的 建立一种用于种属鉴定的线粒体DNA16SrRNA基因和细胞色素b基因荧光标记复合扩增检测体系。方法 利用引物设计软件Primer 5．0对mtDNA序列的16SrRNA基因和细胞色素b基因各设计一对引物,建立复合扩增体系,分别扩增人和牛、猪、狗、鸡、草鱼5种常见动物,用310遗传分析仪对产物进行分析。结果 人和5种动物DNA扩增产物均出现两个峰。Cytb通用引物的扩增产物为人与动物的共有峰,为358bp;16SrRNA基因的扩增产物为人与动物间存在位置差异的特异峰,位于231～256bp之间。结论 该复合扩增体系可以明确区分人和5种动物样本,可用于种属鉴定。     

线粒体DNA短片段复合扩增系统鉴别种属的研究

目的建立线粒体DNA短片段复合扩增体系用于种属鉴定的方法。方法提取人、牛、猪、羊、鸡的DNA,用所选的3对引物复合扩增细胞色素b基因（cyt b）片段、16srRNA基因片段和ND4基因片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。结果人DNA扩增产物在358bp、157bp和110bp处各出现一条带;动物DNA扩增产物均只有358bp一条带。结论线粒体DNA短片段复合扩增鉴别种属的方法可区分人源性生物检材和其它动物样本,可应用于法庭科学实践。     

线粒体16srRNA和ND4基因在种属鉴定中的应用研究

目的构建一种用于种属鉴定的线粒体DNA(m tDNA)16 srRNA和ND4基因荧光标记复合扩增检测体系。方法利用引物设计软件(Prim er 5)对两个m tDNA序列ND4基因和16 srRNA基因设计两对引物,每对引物中的一条在5’端标记荧光素(6-FAM)。按传统复合扩增技术建立复合扩增体系,用AB I PR ISM 310基因分析仪对产物进行分析。结果人类DNA扩增产物出现两个峰,片段大小分别为110bp的人类特异片段和149bp的人与动物共有片段,而动物DNA扩增产物出现一个峰,片段大小为149bp。对30个实验室存放5~15年的陈旧人血痕也能明确判断其种属来源。结论该体系可以明确区分人源性生物检材与其它常见动物样本,对实验室长期存放的陈旧检材也具有较好的检测能力。     

扩增12S rRNA基因鉴定生物检材种属

目的建立一种能够在同一反应条件下鉴定多个具体物种．又满足简单、快速、特异、灵敏、准确等实用要求的种属鉴定方法。方法从GenBank中获取人、鸡、鸭、鹅、猪、兔、鼠、绵羊、水牛、狗、山羊等11个物种的12SrRNA基因序列．设计一对针对上述11个物种的通用引物和分别针对人、鸡和鸭的特异引物,同时扩增各物种12SrRNA基因。以通用引物扩增片段为内部对照．以特异引物扩增片段用于人、鸡和鸭的种属鉴定,并分别对人、鸡、鸭单一检材以及人和鸡、人和鸭、鸡和鸭等二元混合DNA进行鉴定。结果通用引物扩增,各物种均有400bp左右的扩增片段：特异引物只对各自目标种属有扩增产物,片段大小：人163bp、鸡286bp、鸭374bp;测序结果与GenBank既有序列比对,Identities分值：人100％、鸡99％、鸭100％;通用引物扩增人、鸡和鸭检材的灵敏度为2．5Pg;特异引物扩增灵敏度人为2．5pg,鸡、鸭均为200Pg;混合DNA中任一种DNA的含量只要高于检测灵敏度即可被准确检出．不受另一种DNA量的干扰：盲测结果准确。结论本方法可以利用同一种PCR反应条件鉴定多个物种的种属。     

PCR-RFLP分析线粒体DNA细胞色素b基因用于法医学种属鉴定

目的建立一种PCR-RFLP分析线粒体DNAcyt b基因用于法医学种属鉴定的方法。方法采用一对通用引物扩增人及15种常见动物的线粒体DNAcyt b基因,扩增产物经内切酶Alu I酶切,分析不同动物DNA扩增产物的有无以及酶切前后的变化。结果所检动物中有9种DNA有扩增产物,经内切酶Alu I酶切后,除鳝鱼外都能与人类DNA相区别。结论PCR-RFLP分析线粒体DNAcyt b基因方法简单,结果可靠,是一种较好的法医学种属鉴定方法。     

COⅠ基因微条形码技术在毛发种属鉴定中的应用

目的利用COⅠ基因微条形码技术对哺乳动物毛发进行种属鉴定。方法设计一对哺乳动物COⅠ基因微条形码通用引物,利用共同区PCR技术对来自于哺乳纲5个目11个种属的实验动物毛发DNA进行扩增,并对扩增产物进行双向引物测序,将测序结果进行拼接后所得的基因序列输入BOLD数据库进行同源性比对。结果本研究设计的微条形码通用引物能够对所有种属实验动物毛发DNA进行扩增,扩增片段长度147 bp。数据库同源比对结果显示最匹配物种与实验动物种属相符,除狮同源匹配度为98.99%外,其他实验动物同源匹配度均为100%,且狮种内遗传距离1%,种间遗传距离大于种内遗传距离十倍,可以进行种属判定。结论建立的COⅠ基因微条形码技术能够快速准确地对哺乳动物毛发检材进行种属鉴定。     

mtDNA—HVⅠ和细胞色素b片段的复合扩增及其法医学应用

目的探讨复合扩增mtDNA D环HV I和细胞色素b片段进行种属鉴定和个体识别的方法及mtDNA-HV I多态性。方法用两对引物同步扩增HV I片段与细胞色素b片段,银染显带检测扩增产物,ABI377测序仪及荧光测序技术分析扩增产物序列多态性。结果人类有279bp,358bp两条带,动物只有358bp一条带。通过对131例随机广东汉族人群个体进行mtDNA控制区(15997～16236))序列测定统计,得出此区域的序列多态性。共发现69个位点变异,平均每个个体存在2.679个碱基突变,检出67个单倍型,基因多样性为97.92％。结论mtDNA控制区(15997—16236)具有较高的序列多态性。为良好的个体识别标记。复合扩增mtDNA D环HV I与细胞色素b片段进行测序分析可以同步进行种属鉴定和个体识别。     

细胞色素b基因序列测定进行种属鉴定应用研究

目的建立细胞色素b基因序列测定进行种属鉴定的方法。方法应用特异性引物扩增人与14种常见动物细胞色素b基因14817～15174区间长度为358bp的片段,用荧光标记自动测序技术对此片段进行序列测定,比较这些动物与人之间片段的序列差异。结果所有血痕样本均可以得到良好的测序结果,所测14种动物细胞色素b基因358bp的片段序列与人之间均存在明显的差异,最小为20.1%,最大差异为28.5%。结论测定细胞色素b基因序列进行种属鉴定特异性强、适用检材广,具有良好的应用价值。     

人与动物mtDNA细胞色素b基因的序列差异

目的 探讨人与动物之间mtDNA细胞色素b(Cyt-b)基因序列差异及其种属鉴定。方法 采用1对Cyt-b基因通用引物对人和19种动物共171例样本的mtDNA进行PCR扩增,琼脂糖凝胶检测扩增产物,ABI 377测序仪及荧光测序技术分析扩增产物的DNA序列。结果 所有样本均检测到1条358bp的扩增片段;任何两种动物扩增片段的序列都不相同,人与19种动物的序列差异在18.9％-30.0％,19种动物之间的序列差异在5.9％-32.9％。同种动物不同个体间只有人、驴及小白鼠存在变异,最多有4个碱基变异位点(1.3％),其它动物未发现种内变异。结论 人与不同种动物的Cyt-b基因序列存在差异,以此可区分不同种属的动物。     

线粒体DNA cytb和HVI的分析用于种属鉴定

目的以线粒体DNA为目标序列,探讨生物检材的种属来源问题。方法复合扩增线粒体DNA细胞色素b基因(Cb)片段和D-环HVI上人源特异性DNA片段,2%琼脂糖凝胶电泳检测复合扩增产物谱带;用常规测序技术获得种属来源不明的检材Cytb基因序列,登陆美国国家生物信息中心网站主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),将Cytb序列的测序结果用BLAST2.2.9[2004.5.1]进行匹配查询,查询数据库中存在的与其相匹配的物种条目。结果检材经复合扩增后电泳检测可区分人源性检材和非人源性检材;用生物信息法可确定检材种属来源结论检测线粒体DNA细胞色素b基因和D-环HVI的有关序列可在DNA分子水平上鉴别人源性检材和非人源性检材,结合测序的分子生物信息学方法,可对检材进行种属鉴定。     

Identification of DNA of human origin based on amplification of human-specific mitochondrial cytochrome b region

Species-specific differences in a non-polymorphic region of the mitochondrial cytochrome b gene appear to be large enough to allow human-specific amplification of forensic DNA samples. We therefore developed a PCR-based method using newly designed primers to amplify a 157-bp portion of the human mitochondrial cytochrome b gene. The forward and reverse primers were designed to hybridize to regions of the human mitochondrial cytochrome b gene with sequences differing from those of chimpanzee by 26% (7 bp/27 bp) and 26% (6 bp/23 bp), respectively. Using this primer pair, we successfully amplified DNA extracted from blood samples of 48 healthy adults. All these human samples produced a single band of the expected size on agarose gel electrophoresis, and the sequence of the single band was shown to be identical to that of the target region (157 bp) by sequence analysis. On the other hand, no visible bands were amplified from DNA extracted from blood samples of animals including non-human primates (chimpanzee, gorilla, Japanese monkey, crab-eating monkey) and other species (cow, pig, dog, goat, rat, chicken and tuna). Thus, DNA producing a single band following PCR amplification using this primer pair can be reasonably interpreted as being of human origin. In addition, aged biological specimens comprising bloodstains, hair shafts and bones were successfully identified as being of human origin, illustrating the applicability of the present method to forensic specimens.     

扩增Amelogenin基因用于生物检材种属鉴定

目的扩增Amelogenin基因测定血痕或组织的种属,以确定在法医学检验中的应用价值。方法收集猪、羊、马等10几种常见动物的血痕或肌肉组织,应用PCR扩增Amelogenin基因,PAGE电泳,银染后观察结果。结果哺乳动物猪、牛、狗、羊、马、驴动物血痕扩增产物为1条带,片段长度102bp。猕猴检见106bp和112bp两条带,与人血痕没有区别。兔、猫、鼠血痕未检出特异性片段。其它常见物种鳝鱼、青蛙、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、麻雀等均未见扩增产物。结论扩增Amelogenin基因进行种属鉴定,方法简单,灵敏度高,可应用于法医检案。     

扩增TP53内含子8用于生物检材的种属鉴定

目的扩增常见动物TP53内含子8片段,确定其在法医学生物检材种属鉴定中的应用价值。方法收集标本为包括人在内的15种常见动物的血痕或肌肉组织,提取DNA后定量,应用PCR扩增TP53内含子8,PAGE电泳,银染后观察结果。结果人和猕猴都扩增出一条长度为460bp的片段,鳝鱼、鲢鱼、青蛙、鸭、兔、猫、小白鼠、豚鼠、猪、牛、羊虽有扩增产物,但不在分型区内,鸡、狗未见扩增产物。结论扩增TP53内含子8进行种属鉴定,方法简单,灵敏度较高。     

Discrimination between human and animal DNA: application of a duplex polymerase chain reaction to forensic identification

Identification of a report's species is one of the basic analyses in forensic laboratories. The authors report the case of 6 bone fragments recovered in a wooded area, which were not attributable to 1 animal species on the basis of morphologic examination. The aim of this study was to develop a duplex polymerase chain reaction (PCR) to discriminate human and animal origin of bone fragments. The method is based on the PCR amplification of cytochrome b and a 16S ribosomal mitochondrial DNA fragment, which has never been tested up to now. Our protocol combines a single-round PCR with direct visualization of amplicons in agarose gel, without sequencing analysis of the PCR products. The presence of a single band (359 bp) indicates a nonhuman origin of the sample, whereas 2 bands (157 and 359 bp) indicate a human biologic sample.This method revealed to be useful for forensic purposes because the 16S ribosomal mitochondrial DNA is a small human-specific fragment that is easily amplifiable even with degraded DNA from biologic materials such as old bones.     

The application of miniplex primer sets in the analysis of degraded DNA from human skeletal remains

A new set of multiplexed PCR primers has been applied to the analysis of human skeletal remains to determine their efficacy in analyzing degraded DNA. These primer sets, known as Miniplexes, produce shorter amplicons (50-280 base pairs (bp)) than standard short tandem repeat (STR) kits, but still utilize the 13 CODIS STR loci, providing results that are searchable on national DNA databases. In this study, a set of 31 different human remains were exposed to a variety of environmental conditions, extracted, and amplified with commercial and Miniplex DNA typing kits. The amplification efficiency of the Miniplex sets was then compared with the Promega PowerPlex 16 system. Sixty-four percent of the samples generated full profiles when amplified with the Miniplexes, while only 16% of the samples generated full profiles with the Powerplex 16 kit. Complete profiles were obtained for 11 of the 12 Miniplex loci with amplicon sizes less than 200 bp. These data suggest smaller PCR amplicons may provide a useful alternative to mitochondrial DNA for anthropological and forensic analysis of degraded DNA from human skeletal remains.     

洛阳地区5种嗜尸性麻蝇分子鉴定研究

目的应用经典DNA条形码和28S r RNA基因鉴定洛阳地区5种常见嗜尸性麻蝇种属,评价其在常见嗜尸性麻蝇种属鉴定中应用的可行性。方法收集洛阳地区常见嗜尸性麻蝇类标本18只,经形态学分类鉴定后,Chelex-100法提取足部DNA,扩增并测序线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)和28S核糖体核糖核酸(28S r RNA)基因片段,BLAST比对后,与来自DNA条形码数据库(Barcode of Life Data,BOLD)的中国和韩国地区20条相应蝇种序列进行比对,用MEGA 7.0软件整理分析所得序列,计算碱基组成、种内及种间进化分歧率,并构建系统发育树。结果形态学鉴定18只嗜尸性麻蝇归于3属5种。每个样本获得COI和28S r RNA的扩增长度分别为646bp和721bp。在线BLAST比对结果显示样本COI序列相似度99%以上,邻近法构建发育树Bootstrap值为1 000,5种麻蝇可以较好聚类,与形态学鉴定结果一致。38个样本COI种内范围为0~0.022,棕尾别麻蝇、酱亚麻蝇和急钩(亚)麻蝇种间范围在0.057~0.090;赤尾麻蝇和红尾粪麻蝇种间范围在0~0.086。5种麻蝇的28S r RNA序列发育树显示,棕尾别麻蝇和急钩(亚)麻蝇明显各自聚类,其余3种成一类。结论对于本研究中的5种嗜尸性麻蝇,基于COI基因的DNA条形码可以有效区分棕尾别麻蝇、酱亚麻蝇和急钩(亚)麻蝇,28S r RNA基因只可以区分棕尾别麻蝇,二者可作为形态学鉴定之外的重要方法补充。