抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段,将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列;利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV L1和FMDV L2以及作为参考毒株的A22/India/17/77进行序列分析。结果表明,核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列,氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG βH环内,其中毒株FMDV L1和FMDV L2RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异,分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。     

靶向脑心肌炎病毒VP1基因的shRNA对脑心肌炎病毒复制的抑制作用

选择脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因,探讨了shRNA对EMCV复制的影响。设计合成4对编码siRNA的VP1基因的DNA序列,分别构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体X109-1、X109-2、X109-3和X109-4,脂质体介导转染至BHK21细胞,接种EMCV。病毒TCID50和实时荧光定量PCR结果表明,4种重组EMCV VP1shRNA对EMCV的复制均有抑制作用,其中X109-2的抑制作用最显著。X109-2转染BHK21细胞后分别接种EMCV、口蹄疫病毒(FMDV)、乙型脑炎病毒(JEV),EMCV的lgTCID50为3.5,FMDV和JEV的lgTCID50均在7.0以上,说明重组shRNA质粒对EMCV复制的抑制具有明确的特异性和干扰的靶向性。X109-2和pEGFP-VP1真核表达载体共转染CHO-K1细胞后,RT-PCR和Western-blot检测结果表明,VP1shRNA可抑制pEGFP-VP1在细胞中的蛋白表达,进一步证明了干扰载体的靶向性。上述结果为进一步研究EMCV的感染和复制机制奠定了基础。     

口蹄疫病毒A/WH/09株结构蛋白P1基因的克隆及其B细胞抗原表位的预测

对口蹄疫病毒(FMDV)A/WH/09株P1结构蛋白基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果显示,FMDV A/WH/09株P1基因长2 208bp,包含完整的开放阅读框,编码736个氨基酸,其中VP1长636bp,编码212个氨基酸;VP2长654bp,编码218个氨基酸;VP3长663bp,编码221个氨基酸;VP4长255bp,编码85个氨基酸。采用DNAStar Protean软件对P1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行了综合分析,并预测其B细胞的抗原表位分布。结果表明,VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞抗原优势表位,VP4上也有少量潜在的B细胞抗原表位。与已鉴定的B细胞抗原表位相比,本试验所用方法预测的结果有较高的准确度,是一种较为先进的表位研究方法。     

A型口蹄疫病毒衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及免疫效果分析

为了探索更有效的A型口蹄疫(FMD)表位疫苗,根据已鉴定的A型口蹄疫病毒(FMDV)主要抗原位点,结合基因序列比对分析,选择了A型FMDV流行毒株的主要抗原位点区进行表位蛋白分子的设计表达。所用表位序列包括A/QH/CHA/2013的VP2 70～81位、118～140位,VP1 G-H环131～157位、C末端188～212位,A/WH/CHA/09 VP1 43～48位、VP3 55～72位,以及非结构蛋白3A中的T细胞表位和通用性T细胞表位,构建免疫原蛋白分子命名为ANX2和ANX3,其中ANX2采用了表位序列反向串联的方式进行设计,用大肠杆菌表达免疫原基因,纯化表位蛋白免疫小鼠和猪,分析特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,并对免疫猪进行了攻毒保护试验,评价表位疫苗的保护效果。结果显示,ANX2、ANX3重组蛋白以包涵体表达为主,蛋白大小约为41 ku和39 ku,均能与A型FMDV阳性血清发生特异性反应;免疫小鼠和猪后都能产生抗A型FMDV特异性抗体;用表位蛋白刺激免疫小鼠脾淋巴细胞,细胞因子IFN-γ和IL-4均有明显的升高;攻毒后对猪有一定的保护作用,ANX2的免疫效果略优于ANX3,证明表位序列反向串联更有利于抗原表位的展示,从而增强其免疫效果。本研究为A型FMDV表位疫苗的研究积累了经验。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术,扩增出口蹄疫病毒(FMDV)VP2基因,并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞,获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后,感染sf9细胞,表达VP2融合蛋白,分子质量为33 ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体,通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定,说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达,且可以与牛抗O型FMDV血清发生特异性反应。     

重组牛IFN-α对亚洲Ⅰ型口蹄疫亚单位疫苗免疫小鼠的影响

在大肠杆菌BL21(DE3)中分别表达了牛IFN-α基因、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)VP1和VP1 C末端基因,并纯化了所表达的蛋白。用透析的方法进行蛋白复性后制成油乳剂疫苗,经皮下多点注射免疫小鼠,以MTT法检测小鼠脾淋巴细胞经植物血凝素(PHA)刺激后的增殖反应活性;以液相阻断ELISA检测血清FMDV特异抗体的变化。结果表明,重组VP1(rVP1)和rVP1 C末端蛋白能单独诱发小鼠的体液免疫反应和微量的细胞免疫反应,而与重组牛IFN-α(rBoIFN-α)共同接种的小鼠,体液免疫反应和细胞免疫反应更为明显。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的原核表达及其产物的活性检测

利用分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增出FMDV 3ABC基因,将其克隆到pMD18-T载体。经BamHⅠ和SalⅠ酶消化后,克隆到表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pGEX-3ABC。将该重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,经终浓度1 mmol/L的IPTG诱导,获得约70 ku的融合蛋白GST-3ABC。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白GST-3ABC可以与感染FMDV的牛血清发生免疫反应。以纯化的GST-3ABC蛋白为抗原的间接ELISA检测结果与以VP2蛋白为抗原的间接ELISA检测结果相比较,表明,融合蛋白GST-3ABC可以用于鉴别感染FMDV和疫苗免疫的牛血清。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因,继而构建出真核表达载体pVAX-VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上,筛选出VP1表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子,获得转移载体。再经酶切,连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞,转染3次后,细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定,证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2/FMDV。经验证,该重组毒可稳定遗传,其毒价为103.5TCID50/mL。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP2-3-1的纯化复性与活性检测

收集含有口蹄疫病毒结构蛋白VP2 3 1基因的大肠埃希氏菌菌液 ,将其超声破壁 ,用菌体裂解液裂解 ,提取包涵体 ,并用 8mol/L尿素溶解 ,收集上清液 ,用亲和层析法纯化融合蛋白VP2 3 1 ,透析法复性 ,并用间接ELISA检测FMDV阳性血清和阴性血清。结果 ,P/N值大于 2 .1 ,说明纯化复性后的目的蛋白有一定的生物活性     

RGD基序邻近氨基酸突变对口蹄疫病毒O/JC/2010株毒力的影响

为了研究RGD基序邻近氨基酸位点对口蹄疫病毒毒力的影响,利用O/JC/2010株病毒的基因组全长cDNA分子克隆,置换O/HN/93株病毒的VP1基因,拯救获得了1株嵌合病毒(pBlue-HJ);除此之外,在O/JC/2010VP1的3个氨基酸位点进行突变P142T、A152D、Q153P,分为4组,拯救出4株突变病毒:pBlue-HJ(142)、pBlue-HJ(142+152)、pBlue-HJ(152+153)、pBlue-HJ(142+152+153)。比较这5株病毒的LD50和TCID50特性,发现P142T、A152D可以增强口蹄疫病毒对BHK-21细胞和乳鼠的致病力,而Q153P则相反。该试验证明RGD基序附近的非保守氨基酸位点对口蹄疫病毒的毒力存在影响,为进一步阐明口蹄疫病毒的分子致病机制奠定了基础。     

口蹄疫病毒结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒OLZ0 2株基因组序列为材料 ,采用Garnier Robson法、Chou Fasman法和Karplus Schulz法预测了其结构蛋白的二级结构 ,用Kyte Doolittle法分析了各结构蛋白的亲水性 ,Emini法预测了各结构蛋白的表面可能性 ,Jameson Wolf法预测了各蛋白的抗原指数 ,综合评价了口蹄疫病毒结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明 ,VP1蛋白含有的B细胞优势抗原表位最多 ,是研制口蹄疫基因工程疫苗的首选免疫原 ,但其他结构蛋白也含有少量的B细胞抗原表位 ,有的甚至有可能成为优势抗原表位     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

以乳酸杆菌为载体的口蹄疫病毒VP1基因 DNA疫苗猪体免疫试验

给猪口服和肌肉注射以乳酸杆菌为载体的口蹄疫病毒VP1基因DNA疫苗(L.acido SFMD-1),以正向间接血凝试验(IHA)和MTT方法分别检测了免疫后FMDV VP1抗体的动态变化和特异性T细胞增殖反应情况,并与商用FMD油佐剂疫苗、裸质粒FMDV VP1基因DNA疫苗诱导的特异性免疫抗体水平进行了比较。结果显示,口服组猪在免疫后第21d抗体效价达到了1∶2~(7.7),而肌肉注射组猪为1∶2~(3.3)。加强免疫后2周,口服免疫组抗体水平下降到1∶2~(5.3),到第3周快速上升到1∶2~8；与此相对应,肌肉途径免疫组猪抗体效价缓慢地从1∶2~(5.3)上升到1∶2~(6.7)。口服途径和肌肉注射途径的刺激指数(SI)分别为1.93和2.00,2种免疫途径都可以诱导特异性T细胞增殖反应。证实,该疫苗能够在猪体诱发VP1特异性T细胞和B细胞反应,以乳酸杆菌为载体是DNA免疫和预防猪口蹄疫的一种极有前景的方法。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定

不同血清型口蹄疫病毒(FMDV)之间不能产生交叉免疫保护,但是血清学的交叉反应确实存在。本研究旨在建立一种筛选型间交互反应性抗体的方法,以期为解析FMDV血清型间保守的抗原结构奠定基础。本方法主要依据单个B细胞抗体技术,首先采用两种不同的荧光染料FluoProbes 647H和Pacific Blue分别标记O型与A型FMDV 146S灭活抗原,然后利用流式细胞分选技术,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出结合两种抗原的特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,并将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建IgG抗体的重链与轻链表达质粒。将重链与轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行完整抗体表达。结果显示,通过该方法获得了5株FMDV特异性单克隆抗体,其中4株(H64、R82、I16、R29)经间接免疫荧光(IFA)检测都可特异性识别O和A型FMDV;ELISA结果显示,H64、R82、I16与O、A型抗原均具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,I16可特异性结合O、A型FMDV结构蛋白VP2中的线性表位,说明在衣壳蛋白VP2上存在血清型间保守的抗原表位,通过本研究进一步加深了对FMDV抗原结构的认识。     

猪札幌病毒VP1基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立

为了在大肠杆菌中表达猪札幌病毒VP1基因,并以纯化的重组蛋白为抗原建立猪札幌病毒血清抗体ELISA检测方法。采用RT-PCR技术扩增VP1基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,再将所克隆的衣壳蛋白的编码序列亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,将成功构建的原核表达质粒pETSAVCAP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。用纯化的VP1蛋白作为抗原建立了猪札幌病毒血清抗体间接ELISA检测方法并初步用于临床样品的检测。结果显示,猪札幌病毒VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达,Western-blot分析表明该重组蛋白具有良好的反应原性。经对反应条件进行优化,确定间接ELISA的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,且不与其他常见猪病的阳性血清发生交叉反应,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。通过对从多个省份收集的490份猪血清样品进行检测,阳性率为65.31%。表明,以大肠杆菌表达的猪札幌病毒VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可以用于猪札幌病毒抗体的检测。     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

用灭活O型口蹄疫病毒为抗原免疫BALB/c小鼠4次后,取致敏的脾B淋巴细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,经间接ELISA法筛选,最终获得了3株抗O型FMDV的阳性杂交瘤细胞株,命名为2F1、2G7和6H4。血清学试验证明该McAbs能与FMDV抗原结合,具有高度特异性。     

树突状细胞对灭活口蹄疫病毒的泛素化作用

通过制备BALB/c小鼠单核细胞源树突状细胞(DC),构建了树突状细胞与灭活口蹄疫病毒(FMDV)的体外作用系统,考察树突状细胞对灭活FMDV的泛素化作用。收获荷载灭活FMDV后不同时间的树突状细胞,制备树突状细胞裂解液,用SDS-PAGE和Western-blot分析灭活FMDV抗原是否被泛素化。结果发现,在将灭活FMDV荷载于树突状细胞后的第0.5、3、6、10和20 h均可检测到分子质量约为75ku的FMDV蛋白,并且被FK2抗体标记的泛素化蛋白含量明显多于FK1抗体标记的泛素化蛋白含量。说明灭活FMDV被树突状细胞加工提呈的过程包括泛素化作用,并且泛素化蛋白主要在溶酶体内被降解。