土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白基因的原核表达

将pGEM-TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白(TM)基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+),重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达出一37.5 ku的融合蛋白。该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测,出现与目的蛋白大小一致的单一条带。Western-blotting检测结果表明,纯化的蛋白可被自然感染东毕吸虫的山羊血清识别,这为进一步研究东毕吸虫基因工程疫苗奠定了基础。     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫(Orientobilharzia turkestanicum)成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因(TPI),鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接,构建重组表达质粒pPIC9k-TPI,并将其电击转化到毕赤酵母GS115中,重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白,经SDS-PAGE、western-blotting检测,并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示,成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43 ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

内蒙古土耳其斯坦东毕吸虫及其在终末宿主体内发育的研究

通过本试验证实土耳其斯坦东毕吸虫在终末宿主体内发育是:尾蚴侵入皮肤后至第5天皮肤内发现童虫,其中1.5～2.5天皮内童虫最多,并在2.5天开始向肺组织移行,至第6.5天肺组织内发现较多童虫,第8.5天肺组织内童虫数明显减少,并开始向肝脏的静脉管移行。在感染后第12.5天,肺组织内已找不到童虫,肝脏内可找到大量童虫。在感染后22.5天,大量童虫定居在肝脏的门静脉和肠系膜静脉内,同时发现部分配偶合抱的虫体。其结果表明:土耳其斯坦东毕吸虫的移行路线是由皮肤侵入后经静脉管入肺静脉后又随血循环进入肝脏,最终定居肝门静脉和肠系膜静脉,这与日本血吸虫的移行路线基本相同。     

湖南省华支睾吸虫线粒体cox1和nad1基因的克隆及进化分析

为了研究湖南省华支睾吸虫分离株线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位Ⅰ基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列构建华支睾吸虫与其他吸虫的种群遗传进化树。应用聚合酶链反应扩增华支睾吸虫虫株的pcox1和pnad1,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,然后用Phylip3.67程序中的MP法和MEGA4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树。结果显示,所获得的pcox1和pnad1序列长度分别为1 100bp和790bp,种系发育进化表分析表明,25个华支睾吸虫分离株位于同一分枝。证实华支睾吸虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记,从而为华支睾吸虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定基础。     

两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2,并对其进行了测序与分析。结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97.3%~99.9%,与PCV2 ORF2基因的同源性为67.9%~68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明,PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

三个柔嫩艾美球虫虫株线粒体cox 1基因部分序列的比较分析

为研究柔嫩艾美球虫不同毒力株的线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因与球虫种群之间的遗传关系,应用聚合酶链反应扩增柔嫩艾美球虫3个不同毒力株的cox1序列,并与GenBank上登录的鸡柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫和堆形艾美球虫虫株的相应序列进行比对分析.结果显示,每个虫株都获得659 bp的cox1部分有效序列(pcox1).柔嫩艾美球虫不同虫株的pcox1序列完全相同,但与其他种的艾美球虫相应的pcox1序列有不同程度的差异.表明柔嫩艾美球虫的cox1序列可作为艾美球虫不同种虫株之间遗传变异研究的标记.     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NS基因的克隆和序列分析

根据已发表的H5N1禽流感病毒NS基因全序列设计了1对引物,对4株禽流感病毒新疆株的NS基因进行了RT-PCR扩增,并将其克隆到pMD 18-T载体上,分别获得了全长为817、851、8548、54 bp的全基因序列。序列分析结果表明,新疆毒株间的核苷酸同源性为97.8%~98.9%,氨基酸同源性为96.5%~98.7%,与广东、香港和东南亚等不同地区的11个毒株比较,同源性为90.0%~99.4%;与来自野禽、猪等不同种类的11个流感毒株比较,同源性为81.4%~99.3%。系统进化树分析表明,新疆株独立分支。     

新城疫病毒广东分离株HN基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法从6个新城疫病毒(NDV)广东分离株中扩增HN基因cDNA片段,并将其克隆至pGEM T Easy载体进行核苷酸序列测定。结果表明,6个NDV分离株 HN基因片段长度均为1 704 bp,编码568个氨基酸;彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为 96.0%~99.8%和98.6%~100%,与其他基因Ⅶ型毒株的氨基酸序列同源性为 96.8%~98.4%;但与其他基因型毒株如D26、Ulster/67、B1、LaSota以及GB Texas的氨基酸同源性较低,为88.2%~91.0%。     

片形吸虫线粒体nad1基因的序列分析及种系发育

为阐明来自中国、尼日尔、法国和美国的片形吸虫分离株在线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并以pnad1序列进行种系发育研究,利用PCR扩增了中国、尼日尔、法国和美国片形吸虫分离株的pnad1序列并与GenBankTM中片形吸虫相应序列进行了比较,进行了种系发育分析.结果显示,所有片形吸虫样品的pnad1序列长度均为446 bp,中国、尼日尔、法国和美国肝片吸虫分离株与GenBankTM公布的肝片吸虫相应序列的种内变异为0.2%～0.7%,0.2%～0.9%,0.9%～2.0%,0.2%～0.9%;中国及尼日尔大片吸虫分离株与已报道的大片吸虫相应序列的种内变异为1.8%～2.7%,1.8%～3.4%;中国中间型虫株与中国及尼日尔大片吸虫分离株以及网上报道的大片吸虫的序列差异为5.6%～6.3%,5.6%～7.8%,5.7%～8.1%.中间型片形吸虫在遗传学上介于大片吸虫与肝片吸虫之间,但与大片吸虫的遗传关系更近.表明,片形吸虫pnad1序列可作为种间鉴定及种内遗传变异研究的标记;在中国的确存在中间型片形吸虫.     

新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

设计了 2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约 4 .1kb的V 4LA片段 ,用V4L3、V4L4扩增出约 3.5kb的V 4LB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接 ,得到长约 7.2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为 6 70 4bp ,拥有 1个 6 6 15bp的开放阅读框 ,推测其编码的氨基酸数为 22 0 4个。氨基酸同源性分析表明 :V4克隆株与HB92V4株L基因的同源性为 99.0 % ,与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株 )、BeaudetteC、Clone30、F4 8E9、SF0 2和ZJ1株的同源性为 94 .1%～96 .5 %。     

新加坡1＋1自由贸易区建设

在欧盟、北美自由贸易区等地区性自由贸易进行得如火如荼之时 ,新加坡在东亚经济危机以后也加紧自身1+1双边自由贸易区的建设工作,并与一些国家达成了有关的协议 ,取得了一定的成效。这成为亚洲国家和地区展开FTAs合作的重要范本。     

我国对外关系大事记(2002年1月1日-3月1日)

亚 洲 １月３日 朱基总理会见参加南亚区域合作联盟（南盟）首脑会议途中过境中国的巴基斯坦总统穆沙拉夫。 １月７日 朱总理与蒙古国总理恩赫巴亚尔举行会谈。８日，江泽民主席、李鹏委员长分别会见了他。 １月１０日 李委员长与韩国议长李万燮举行会谈。１１日，江主席和李     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达

利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析。结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B。再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1。经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21(DE3)(pLysS)感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白。用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性。     

组成新发典型甲型H1N1流感病毒8个基因片段的变异性分析与疫病流行原因初探

为探索新近暴发的甲型H1N1流感病毒各基因片段的变异性与本次疫病流行的内在原因,以NCBI GenBank中报道的l株新发的典型H1N1甲型流感病毒A/New York/1669/2009(H1N1)作为研究对象,运用在线BLAST和CLUSTAL X等生物信息学软件对其PA、NP、M、PB1、PB2、NA、HA和NS基因片段进行了比较分析.结果表明,新发甲型H1N1流感毒株的PB1、NP基因来源于人源谱系流感病毒,HA、NA、NS、M基因来源于猪源谱系流感病毒,PB2和PA基因来源于禽源谱系流感病毒.此外,新发甲型H1N1流感病毒的HA和NA分别在第249和386位新出现1个"-NTT-"、"-NFSI-"的糖基化位点.HA的6个潜在抗原决定簇中有3个发生了氨基酸序列改变,NA则是12个中有5个发生了改变.表明,这些抗原基因的大范围重组与高频率变异可能是造成这次流感暴发与大规模流行的根本原因.     

猪IFN-α1基因的原核表达及其蛋白质结构的预测

利用RT-PCR技术,从被诱导的猪外周血单核细胞中克隆出了猪α1干扰素(IFN-α1)基因.序列分析表明,克隆的猪IFN-α1基因序列与GenBank上登录的猪IFN-α1基因的同源性为97.8%.用克隆的猪IFN-α1基因构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-IFN-α1.探讨了猪IFN-α1.基因表达的最佳条件,并在大肠杆菌中对此基因进行了表达.结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为42℃,诱导9h表达量最大,表达产物约占菌体总蛋白的30%.SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子质量为45 ku,且目的蛋白主要以包涵体的形式存在.经预测,猪IFN-α1蛋白为一结构松散的球状蛋白.     

猪圆环病毒Ⅰ型ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)ORF1基因序列,设计合成了1对引物,对PCV1 ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(939 bp)克隆入pMD18-T载体,将筛选获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。测序分析表明,克隆的ORF1与广东分离株DQ659154的核苷酸序列同源性高达99.6%,推导的氨基酸序列同源性为99.4%。将ORF1双酶切产物插入原核表达载体pET-41a,得到的重组子命名为pET-ORF1。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,PCV1ORF1在pET-41a中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为67.6 ku。     

1型鸭肝炎病毒E53株和HP-1株全基因组序列分析

根据已发表的1型鸭肝炎病毒(DHV-1)基因组序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法对DHV-1 E53株和HP-1株的基因组序列进行分段扩增并测序.BLAST分析确定为DHV-1型基因组序列,GenBank登录号分别为EF151313和EF151312.E53株与已发表的参考毒株的核苷酸同源性为94.6%～99.4%;HP-1株与已发表的参考毒株的核苷酸同源性为94.4%～99.6%.系统进化树分析结果表明,E53株与北京BJ株进化关系最近;HP-1株与R85952株进化关系最近.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒(AIV)A/Goose/HLJ/p46/2003(H5N1)的NS1基因,将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上,转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析,表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示,重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后,经0.3mmol/L的IPTG诱导,融合蛋白MBP-NS1得到大量表达,融合蛋白以可溶形式存在,分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明,融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应,而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法,为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。