质粒指纹图谱法对猪大肠杆菌病的分子流行病学研究

对从母猪和发病仔猪肛拭标本中分离的５株普通大肠埃希氏菌和７０株致病性大肠埃希氏菌进行了质粒指纹图谱分析，并对二者的关系进行了比较。结果表明，７０株致病性大肠埃希氏菌共分为３２种质粒谱型，质粒含有４．４×１０２～９．６２×１０４ｂｐ，相同来源的菌株属于同一种质粒谱型，不同来源的菌株属于不同的质粒谱型。从母猪和发病仔猪肛拭标本中分离的大肠埃希氏菌具有不同的质粒图谱和质粒酶切图谱，提示二者之间无同源性。本试验结果亦证明质粒指纹图谱法适用于大肠埃希氏菌菌株的分型鉴定，是一种简单、快速、有效的方法。     

鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的检测

对分离的20株鸡源致病性大肠埃希氏菌进行药敏试验,筛选出13株耐氧氟沙星(OFL)的菌株,进行质粒提取、电泳和转化试验,获得1株由质粒介导的耐OFL多重耐药菌株.该菌株对参试的11种抗生素全部耐药,其中OFLMIC高于50μg/mL.该菌R质粒电泳可见6条带,转化大肠埃希氏菌DH5α在含20 μg/mL OFL的LB平板筛选得到转化子.该转化子含有原菌株中2.7×103b的质粒,获得原菌株部分耐药性.连续转化5次,均获得耐OFL的转化子,证实该菌株对OFL的耐药性由质粒介导.     

应用质粒图谱分析大肠埃希氏菌毒力差异的研究

对1株无致病性鸡源大肠埃希氏菌(O21)和5株已知毒力强弱的大肠埃希氏菌(O2、O1、X2、148和O78)进行质粒图谱(PP)分析.结果表明这6个菌株属于不同的6种质粒谱型,其毒力的强弱与其所携带质粒的数量和大小有关,但不同毒力株间也有少数几条相同大小的谱带.试验结果表明PP图谱法可作为大肠埃希氏菌分型和鉴别其毒力的间接分子生物学方法.     

鸡源大肠埃希氏菌大质粒的探讨

用碱裂解法提取分离的10株鸡源大肠埃希氏菌的质粒.结果多数大肠埃希氏菌菌株含有大质粒,分子量为50～230kb.这些大质粒可能含有毒力相关基因,与细菌的耐药性、大肠埃希氏菌素的产生及质粒的传递功能等有关.     

广东省鸡源弯曲杆菌的耐药性调查与PFGE分型

为研究广东省鸡源弯曲杆菌的耐药性及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型与耐药的相关性,测定了42株空肠弯曲杆菌和33株结肠弯曲杆菌对6类12种抗菌药物的最小抑菌浓度并进行了PFGE分型分析。耐药性结果显示,这些弯曲杆菌对12种抗菌药物表现出较强的耐药性,对喹诺酮类药物的耐药率达100%,其中结肠弯曲杆菌对6大类抗菌药物的耐药率高于空肠弯曲杆菌,对大环内酯类药物、氨基糖苷类药物、克林霉素的耐药性达60%以上,而空肠弯曲杆菌对这些抗菌药物较为敏感。PFGE分型结果显示,弯曲杆菌基因型呈现多态性,大部分空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌具有相似的耐药模式,均可分为27个不同的PFGE型,包含6个PFGE基因簇。结果表明,鸡源弯曲杆菌对喹诺酮类药物高度耐药,出现了对喹诺酮类+四环素类+氟苯尼考等多种耐药菌谱,同型弯曲杆菌菌株与耐药性具备一定的相关性。     

中草药消除大肠埃希氏菌耐药性及耐药质粒的研究

在系统鉴定和药敏试验的基础上,对9株大肠埃希氏菌多重耐药菌株进行耐药基因定位,结果表明有4株菌株的氨苄青霉素耐药基因位于质粒上.通过对中草药煎煮、水蒸气蒸馏等方法提取其有效成分,对耐药大肠埃希氏菌进行耐药性消除试验,结果发现大蒜油等对大肠埃希氏菌氨苄青霉素耐药性有消除作用;鱼腥草、紫草等对大肠埃希氏菌庆大霉素耐药性及耐药质粒有消除作用,消除率分别为2.98%和4.20%.     

耐环丙沙星患病动物源沙门菌的多重耐药分子特征

采用13株耐环丙沙星食品动物源沙门菌进行喹诺酮类作用靶位基因及质粒介导耐药基因的扩增测序、有机溶剂耐受试验、HeLa细胞侵袭试验,探讨其多重耐药的分子特征。结果显示,菌株均携带质粒介导的喹诺酮耐药基因,7株对环丙沙星敏感性降低或低水平耐药(最小抑菌浓度0.125～4μg/mL),靶位基因无突变或gyrA单位点突变及外排泵活性增强;5株对环丙沙星高水平耐药(最小抑菌浓度32～128μg/mL),均在gyrA和parC发生双位点突变及外排泵活性增强,其中4株携带β内酰胺酶blaCTX-M基因。对环丙沙星高水平耐药的沙门菌的侵袭力显著高于敏感菌株。表明患病食品动物源沙门菌中,无论外排能力增强与否,gyrA单位点突变或质粒介导的喹诺酮耐药基因阳性,仅导致沙门菌对环丙沙星的低水平耐药;而外排泵机制联同染色体靶位基因突变可导致菌株对环丙沙星的高水平耐药,往往同时携带blaCTX-M基因;临床分离沙门菌随着对环丙沙星耐药程度的增加侵袭力增强。     

猪场环境中大肠杆菌的耐药性检测及其耐药机理

为探讨猪场环境中大肠杆菌的耐药性及其耐药机理,随机选取从规模养猪场环境中分离的31株大肠杆菌,采用药敏纸片法检测其耐药性、PCR法检测其qnrA和aac(6’)-Ib基因存在状况,然后采用高温-SDS法对其中1株分离菌进行耐药质粒消除试验。结果显示,所分离的31株大肠杆菌对青霉素、四环素、洁霉素、红霉素、罗红霉素等抗生素呈现不同程度的耐药性;在所有试验菌株中未检出qnrA基因,而可检出aac(6’)-Ib基因的有8株;通过对含aac(6’)-Ib基因质粒的消除,分离菌株可获得对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素的敏感性。表明猪场环境中的大肠杆菌对临床常用药物产生了广泛的耐药性,而含aac(6’)-Ib基因质粒可介导环境中的大肠杆菌对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素耐药。     

鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌流行株耐药质粒的研究

对分离到的９株鼠伤寒沙门氏菌和５株福氏志贺氏菌进行药敏试验、质粒提取和电泳分析，各菌株均分离出２～４条质粒带。将含有３．２７×１０４，３．０１×１０４和６．０１×１０４ｂｐ的质粒转化给大肠埃希氏菌ＨＢ１０１，使ＨＢ１０１获得了相应菌株的部分耐药性，用转化有３．２７×１０４ｂｐ的ＨＢ１０１注射小白鼠，１５ｄ后用相应的原始鼠伤寒沙门氏菌强毒株攻击，结果使小白鼠获得了保护；用含有３．２７×１０４ｂｐ质粒的ＨＢ１０１灌服免疫豚鼠，１５ｄ后用相应的强毒鼠伤寒沙门氏菌攻击，结果免疫豚鼠获得保护，对照鼠死亡。说明３．２７×１０４ｂｐ的质粒中携带有原始鼠伤寒菌的保护性抗原基因。菌株间质粒电泳图谱和转化菌株的耐药试验表明，菌株的不同耐药性基因由不同分子质量的质粒所携带，不同菌株中携带质粒的数量和大小不同，在临床上表现为菌株间的耐药性不同。     

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiC突变株的构建与鉴定

为了研究spiC基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用同源重组方法构建该基因缺失株。以鸡白痢沙门菌S06004基因组DNA为模板,PCR扩增spiC基因上、下游DNA片段作为等位基因;将上游片段、卡那霉素抗性基因(KmR)及下游片段依次连接并克隆到pGMB151自杀性质粒上,构建重组自杀质粒pGMB151-ΔspiC/KmR,通过大肠杆菌χ7213与鸡白痢沙门菌S06004固相杂交,将质粒转入S06004中,运用反向筛选法获得含KmR基因的spiC基因缺失株(ΔspiC/KmR);再使用编码FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20敲除KmR,获得无抗性ΔspiC。PCR鉴定和测序结果显示,spiC基因被成功缺失。血清型、生化特性、生长特性、耐药性等鉴定表明,S06004ΔspiC未发生理化特性改变。本研究成功构建了spiC基因缺失株S06004ΔspiC,为进一步研究鸡白痢沙门菌致病性变化及spiC基因的功能奠定了重要基础。     

双顺反子表达质粒在DNA疫苗研究中的应用

简述了DNA疫苗的研究概况,介绍了真核双表达质粒的结构特点及其在基因佐剂和二价DNA疫苗中的应用情况,总结分析了双表达质粒的优点和存在的问题,并对其今后在DNA疫苗中的研究方向和前景进行了展望。     

鸡传染性支气管炎病毒四川分离株N基因DNA免疫质粒的构建

采用SDS 蛋白酶K法抽提鸡传染性支气管炎病毒(IBV)四川分离株SAIBWJ的基因组RNA,参照基因库中的N基因序列设计了1对引物,扩增出了单一的DNA产物。将该产物插入pUC18载体的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,构建了pUC NWJ质粒。序列测定结果表明,获得的克隆质粒包含了全部N基因。再将N基因亚克隆到pcDNA3.1( )载体的HindⅢ和XhoⅠ酶切位点,构建了IBVSAIBWJN基因的DNA免疫质粒pcDNA NWJ。     

口蹄疫病毒真核表达质粒的构建及序列分析

根据定点突变的原理 ,获得包含有口蹄疫病毒P1、2A、3C及部分 2B编码区的目的基因片段 ,经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后 ,与经同样处理的真核表达质粒载体 pcDNA3.1(+ )连接。经鉴定及DNA序列分析 ,口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(+ )上 ,且目的基因上的XbaⅠ位点成功突变     

新城疫病毒F48E9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建

将新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因1700 bp克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建成表达F基因的载体pc3F.然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的3800 bp DNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒(HVT)非必须片段载体pTK2B中,构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒载体pTK3F.经限制性内切酶酶切分析,F基因表达盒的插入方向与pTK2B中TK基因转录方向一致.该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的HVT重组病毒奠定了基础.     

复方蒲公英对金黄色葡萄球菌耐药质粒的体外消除试验

通过以复方蒲公英注射液为消除剂、十二烷基硫酸钠为对照组消除剂,以从患有乳腺炎乳牛的乳汁中分离的多重耐药菌株为靶细菌进行耐药质粒体外消除试验,用质粒DNA抽提与琼脂糖凝胶电泳方法观察复方蒲公英注射液对该耐药菌株质粒的影响,探讨了复方蒲公英注射液作为消除剂的可能性。结果显示,复方蒲公英注射液对耐药金黄色葡萄球菌作用24h,其1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的消除率分别为2%、2.6%、3.6%,延长作用时间至48h,其1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的消除率分别为2.8%、3.6%、4.4%。证实,复方蒲公英注射液对金黄色葡萄球菌耐药质粒有消除作用,可用于临床治疗耐药金黄色葡萄球感染。     

轮状病毒VP4蛋白与热稳定肠毒素融合基因的克隆及其植物表达载体的构建

利用DNA重组技术,将用PCR扩增来的 VP4-ST融合基因分别克隆到原核表达载体pThioHisB及植物表达载体 pBin438 中,成功构建了重组表达质粒 pTh-VP4-ST和 pB-VP4-ST。将pTh-VP4-ST进行SDS-AGE分析,结果表明,表达的目的蛋白以包涵体形式存在,大小约 40ku;同时将pB-VP4-ST转化了农杆菌EHA105。     

布鲁氏菌bp26基因缺失株的构建

选择含有反向筛选基因sacB标记的pRE112质粒为自杀载体,利用等位基因交换的方法成功敲除了布鲁氏菌弱毒疫苗S19株、S2株、M5株的bp26基因,构建了具有非抗性基因标记的缺失株S19-Δbp26、S2-Δbp26、M5-Δbp26。将构建的重组自杀质粒pRE-Δbp26(缺失了bp26基因的681个碱基)电转化入布鲁氏菌后,经过5μg/mL氯霉素筛选单交换子和70g/L蔗糖筛选同源重组双交换子,用菌落PCR及DNA测序的方法进行验证。结果表明,bp26基因的缺失改造成功,连续传20代后菌落PCR及DNA测序的结果显示突变株具有遗传稳定性。以pRE112自杀质粒为基础构建无抗性基因标记的布鲁氏菌缺失株为布鲁氏菌的基因功能研究奠定了基础,同时Δbp26缺失株的构建可为新型布鲁氏菌疫苗的研制奠定基础。     

放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

为了筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白在肺泡上皮细胞上的作用受体,应用酵母双杂交技术构建诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,进行酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-omp在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用。结果表明,成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-omp,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。表明pGBKT7-omp可应用在酵母双杂交系统中,用于寻找猪肺泡上皮细胞cDNA文库中与omp相互作用的蛋白质。     

猪瘟病毒囊膜蛋白基因pcDNA4.0-E重组质粒的构建及其对小鼠的免疫原性

以猪瘟病毒石门株RNA序列为模板,应用RT-PCR方法,克隆得到猪瘟病毒囊膜蛋白E0-E2cDNA全序列,并将其与真核表达质粒pcDNA4.0定向连接,构建了重组质粒pcDNA4.0-E。经提纯后,给试验组小鼠后肢胫前肌注射pcDNA4.0-E,每只100μg,15 d后再注射1次,同时设空白对照组。于二免后第10、203、0 d分别扑杀小鼠,进行免疫小鼠脾和外周血淋巴细胞的转化增殖试验,并用间接ELISA法检测血清抗体水平。结果显示,与空白对照组相比,所构建的重组质粒能够极显著增强小鼠脾细胞和外周血淋巴细胞的增殖(P<0.01),血清抗体水平从二免后的第10 d开始逐渐升高,且极显著高于对照组(P<0.01)。说明该重组质粒能够诱导小鼠产生特异性免疫反应。